血小板衍生生长因子b突变体、其制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及血小板衍生生长因子B衍生物，具体地，本发明涉及血小板衍生生长 因子B突变体，编码该突变体的核酸分子，含有该核酸分子的载体和宿主细胞。本发明还涉 及所述突变体的制备方法和纯化方法，以及所述突变体用于制备促进细胞分裂、增殖、促进 伤口愈合、皮肤再生、骨骼与牙齿缺损再生、关节修复的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 血小板衍生生长因子（Platelet-derivedgrowthfactor，F1DGF)是一种能多种细 胞产生的、能够刺激间质来源细胞增殖的多肽，上世纪70年代首先由Ross等从血小板中发 现，因而得名（1)。到目前为止，共发现4种PDGF单体PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D。 这些单体彼此通过链内及链间二硫键，形成5种同源或异源二聚体：H)GF-AA、TOGF-BB、 H)GF-AB、roGF-CC和H)GF-DD(2, 3)。普遍认为I3DGF基因和蛋白属于一类在结构与功能上相 关的生长因子家族，这个家族还包括血管内皮生长因子（VEGFs)以及胎盘生长因子（PIGF) (4)。I3DGF通过激活其受体I3DGF-R发挥生理功能。I3DGF-R包括I3DGFR-a和TOGFR-P两 种，属于酪氨酸激酶受体。配体与受体结合引发受体单体的二聚化，促使胞内区的酪氨酸 残基自体磷酸化而激活。两种受体可以激活多条信号通路关键分子，如Ras-MAPK、PI3K和 PLC-Y(5)，进而激活相关基因的转录，刺激细胞生长、抑制凋亡，促进分化，引起定向移动 和迁移等，发挥多种多样的生物学功能。
[0003] roGF-b基因定位于第22号染色体，含有7个外显子基因，编码241个氨基酸组 成的前体蛋白，经蛋白酶水解加工形成的最终成熟产物是109个氨基酸组成的，分子量为 12. 3kD的多肽。在生物体内，TOGF-B蛋白的活性形式是由两条单体通过二硫键形成同源 TOGF-BB或异源二聚体TOGF-AB(6)。每条TOGF-B蛋白单体含有8个高度保守的半胱氨酸 残基，其中6个半胱氨酸两两形成链内二硫键（CysI-VI，III-VLV-VDI)，另外两个则与 对应单体之间交叉形成链间二硫键（CysII-IV)(7)共同形成TOGF蛋白家族特征性的生 长因子结构域一半胱氨酸结。这些链内及链间二硫键构成了TOGF-BB二聚体蛋白复杂的空 间结构（图1B)。
[0004] 另外，PDGF蛋白在表达合成时还存在不同剪切形式，使得加工成熟后的TOGF蛋白 呈现多种结构形式。从人血小板提取物中分离纯化的H)GF-BB，通过N端氨基酸序列分析表 明存在至少三种不同的剪切形式，20%Serl，45%Thr6及35%Thr33,这些切割的异质性， 致使在纯化I3DGF-BB时各种切割形式的蛋白比例不可控（8)。
【发明内容】
[0005] 本发明的发明人经过大量研究，发现特定位点蛋白酶降解和/或糖基化修饰是造 成多种TOGF-B存在的主要原因，进而通过位点突变获得了TOGF-B突变体，其蛋白均一性大 大提高，并且仍保留TOGF-B蛋白的活性。
[0006] 本发明第一方面涉及血小板衍生生长因子B突变体，其在野生型血小板衍生生长 因子B的第101位和第109位氨基酸位点处具有突变（此处对氨基酸位点位置的描述均以 含109个氨基酸残基的成熟TOGF-B为基础，以下同），并且具有血小板衍生生长因子B的活 性。
[0007] 根据本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，其在第6位氨基酸 位点处具有突变，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。
[0008] 根据本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，其在第32位和/或 第33位氨基酸位点处具有突变，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。
[0009] 根据本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，与野生型血小板衍 生生长因子B相比，其N端缺失5个氨基酸，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。
[0010] 在本发明的一个实施方案中，所述突变体在第6位、第101位和第109位氨基酸位 点处突变为丙氨酸。
[0011] 在本发明的另一个实施方案中，所述突变体在第101位和第109位氨基酸位点处 突变为丙氨酸。
[0012] 根据本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，其在第32位和/或 第33位氨基酸位点处突变为脯氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。
[0013] 在本发明的一个实施方案中，其在第32位氨基酸位点处突变为脯氨酸、缬氨酸或 异亮氨酸，优选为脯氨酸。
[0014] 根据本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，其中所述的血小 板衍生生长因子B为哺乳动物来衍生的血小板衍生生长因子B，所述哺乳动物例如为人、小 鼠。
[0015] 在本发明的一个实施方案中，所述血小板衍生生长因子B突变体为，其N端缺失5 个氨基酸，其第6位、第101位和第109位氨基酸突变为丙氨酸，其第32位氨基酸突变为脯 氨酸。
[0016] 在本发明的一个实施方案中，所述血小板衍生生长因子B突变体为，其N端缺失5 个氨基酸，其第101位和第109位氨基酸突变为丙氨酸，其第32位氨基酸突变为脯氨酸。
[0017] 在本发明的一个实施方案中，所述血小板衍生生长因子B突变体为，其N端缺失5 个氨基酸，其第6位、第101位和第109位氨基酸突变为丙氨酸，其第32位氨基酸突变为缬 氨酸。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，所述血小板衍生生长因子B突变体为，其N端缺失5 个氨基酸，其第6位、第101位和第109位氨基酸突变为丙氨酸，其第32位氨基酸突变为异 亮氨酸。
[0019] 本发明还包括上述各种技术方案的组合。
[0020] 在本发明的具体实施方案中，所述突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:3或SEQID NO:5所示的序列。
[0021] 根据本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体，其氨基酸序列经过 取代、缺失或添加一个几个氨基酸，并且具有血小板衍生生长因子B的活性。
[0022] 本发明第二方面涉及血小板衍生生长因子同源或异源二聚体，其由两个本发明第 一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体通过链内及链间二硫键结合而成，或者由一 个本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体与一个血小板衍生生长因子A通 过链内或链间二硫键结合而成。
[0023] 在本发明中，所述血小板衍生生长因子同源或异源二聚体的形成方式与野生型血 小板衍生生长因子相同。
[0024] 在本发明的实施方案中，两个本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突 变体通过链内及链间二硫键结合，形成I3DGF-BB突变体。
[0025] 本发明第三方面涉及核酸分子，其编码本发明第一方面任一项的血小板衍生生长 因子B突变体。
[0026] 根据本发明第三方面任一项的核酸分子，其核苷酸序列选自SEQIDNO:4、SEQID NO:6~SEQIDNO:9 的序列。
[0027] 本发明第四方面涉及载体，其含有本发明第三方面任一项的核酸分子。
[0028] 在本发明中，本领域技术人员可以根据用于表达的宿主细胞的不同来选择表达载 体，例如可以选择适合酵母细胞或哺乳动物细胞表达的载体。
[0029] 在本发明的实施方案中，所述载体为pMEX9K。
[0030] 本发明第五方面涉及宿主细胞，其含有本发明第四方面任一项的载体。
[0031] 根据本发明第五方面任一项的宿主细胞，其为真核细胞，例如为酵母细胞、哺乳动 物细胞或昆虫细胞。
[0032] 根据本发明第五方面任一项的宿主细胞，所述酵母细胞例如为毕赤酵母细胞 (Pichiapastoris，也叫巴斯德毕赤酵母细胞）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、 克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis)、汉逊酵母（Hansenula)、念珠酵母（Candida)或球拟 酵母（Torulopsis)。
[0033] 在本发明的实施方案中，所述毕赤酵母细胞为GS115细胞。
[0034] 根据本发明第五方面任一项的宿主细胞，所述哺乳细胞例如为CHO细胞、BHK细 胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK-293细胞、COS细胞等。
[0035] 本发明还涉及本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体的制备方 法，其包括取本发明第五方面任一项的宿主细胞进行培养、表达（例如诱导表达）以及任选 的纯化的步骤。
[0036] 根据本发明任一项的制备方法，其包括以下步骤：
[0037] 1)取本发明第五方面任一项的宿主细胞接种至培养基中，经过逐级放大培养；
[0038]2)收集宿主细胞，将重组细胞重悬于培养基中，添加甲醇开始诱导表达；
[0039] 3)诱导表达结束后收集培养上清，经纯化获得血小板衍生生长因子B蛋白。
[0040] 根据本发明任一项的制备方法，其特征在于以下几项中的一项或数项：
[0041] (1)步骤1)中的宿主细胞为单克隆细胞株；
[0042](2)步骤1)中所述的逐级放大培养是指两级放大培养，培养温度为28-30°C，每级 均培养至OD6。。为1-12、例如2-6;
[0043] (3)步骤2)中诱导表达的温度约为28°C;
[0044](4)步骤2)中甲醇的终浓度为0? 3-1. 0 % (v/v)，例如0? 4-0. 8 % (v/v)，例如 0. 5% (v/v)；
[0045] (5)步骤2)中诱导表达的时间为48-96h，例如为72h;
[0046] (6)步骤3)中的纯化步骤依次包括疏水层析、离子交换层析、凝胶层析。
[0047] 本发明第六方面涉及血小板衍生生长因子B或其突变体的纯化方法，其包括取含 有血小板衍生生长因子B或其突变体的培养上清或细胞裂解液依次进行疏水层析、离子交 换层析和凝胶层析的步骤。
[0048] 根据本发明第六方面任一项的纯化方法，其中所述血小板衍生生长因子B突变体 为本发明第一方面任一项的血小板衍生生长因子B突变体。
[0049] 在本发明的实施方案中，用于疏水层析的层析柱介质为Phenyl Sepharose6Fast Flow。
[0050] 在本发明的实施方案中，用于离子交换层析的层析介质