用于六种猪病病原鉴别的基因芯片及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及一种猪传染性胸膜肺炎放线杆 菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒6 种病原鉴别检测的芯片装置及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪支原体肺炎（Mycoplasmapneumoniaeofswine,MPS)、猪传染性胸膜肺 炎（porcinecontagiouspleuropneumonia，PCP)、猪多发性衆膜炎与关节炎（Swine polyserositisandarthrithis)、猪圆环病毒相关疾病（porcinecircovirusassociated disease,PCVAD)、猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratory syndrome，PRRS)和猪痕（classicalswinefever,CSF)分别是由猪肺炎支原体 (Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)、副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,Hps)、猪圆环病毒（ porcinecircovirustype2,PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductive andrespiratorysyndromevirus,PRRSV)和猪痕病毒（classicalswinefever virus，CSFV)引起的一类急性、接触性传染病，广泛存在于世界各地，严重影响我国养猪 业的发展。临床上，常出现几种病原体混合感染或继发感染的现象，不仅加大对猪群的危 害，而且增加了病原诊断难度。九十年代中期，北美提出猪呼吸道疾病综合症（Porcine respiratorydiseasecomplex,PRDC)，该综合症是由病毒、细菌、支原体、寄生虫及不当管 理条件等综合因素引起的一种呼吸道疾病，普遍存在于丹麦、中国、美国等多个国家。该病 多发于6-10周龄保育猪和13-20周龄育肥猪，发病率为10%-40%，死亡率可达2%-20%。保 育猪暴发PRDC，死亡率较高，生长育肥猪发生PRDC，病程较长，生长缓慢，饲料转化率较低， 养殖成本增加，为集约化养猪造成巨大的经济损失。流行病学调查发现，PRDC-般为混合 感染或继发感染，其中PRRSV、PCV-2、Mhp、APP、HPS和CSFV均为造成PRDC的病原体。快速 确定病原体是防治疾病的关键。目前，对呼吸道疾病综合症相关病原的诊断多采用病毒分 离鉴定、血清型方法及分子生物学方法，但未建立同时鉴别检测六种病原体的可行方法。在 不同国家、不同地区，由于地理环境、饲养管理水平及品种差异，PRDC病原谱也存在差异性。 因此，针对我国引起PRDC的主要病原，建立同时检测六种病原的寡聚核苷酸芯片检测方法 具有重要的意义。也便于对出入境的肉制品进行快速检测。
[0003] 基因芯片（Gene chip)是由DNA或寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛基、 氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形成的探针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用特异 性探针与经过适当方式标记的待检样品DNA通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测 设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品种类，完成疾病检测和基础研究等方面的工 作。该方法具有高通量、平行化、微量化、自动化、低成本的优点。因此，该技术被广泛应用 于诊断检测、差异表达分析、测序等诸多领域。目前，基因芯片检测技术已应用于多种疾病 的检测，但缺乏六种病原体并行检测的技术。综合寡聚核苷酸芯片的优点，本发明建立一种 快速、准确鉴定猪常见病原体的基因芯片检测技术，为控制PRRSV、PCV-2、Mhp、APP、HPS和 CSFV的传播及进出境动物的检疫具有重要作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微 阵列芯片用于检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒 2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的基因芯片。
[0005] 为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：用于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、 副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒检测 的基因芯片，包括：PCR反应混合液、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH 20、检测 芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量 点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列， 所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区： 点样位置质控分区P1，包含至少一个点样位置质控探针：SEQ ID N0. 7 ; 杂交阳性质控分区P2,包含至少一个杂交阳性质控探针：SEQ ID NO. 8 ; 杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液； 所述待测样品探针区内设置下述至少一个待测样品探针的分区： 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针分区；副猪嗜血杆菌探针分区；猪肺炎支原体探针分 区；猪圆环病毒2型探针分区；猪繁殖与呼吸综合征病毒探针分区；猪瘟病毒探针分区。 [0006] 各个探针序列如下： 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针：SEQ ID NO. 1 ; 副猪嗜血杆菌探针：SEQ ID NO. 2 ; 猪支原体肺炎探针：SEQ ID NO. 3 ; 猪圆环病毒2型探针：SEQ ID NO. 4 ; 猪繁殖与呼吸综合征病毒探针：SEQ ID NO. 5; 猪瘟病毒探针：SEQ ID NO. 6。
[0007]利用上述基因芯片检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原 体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的检测方法，包括如下步骤： (1) 待测样品制备：按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织 或病毒的细胞增殖液的全基因组DNA/RNA，制备待测样品DNA/cDNA; (2) PCR扩增：25 yLPCR反应液包含：rTaq酶12.5 yL、引物Mix: 2.9yL、待测样 品DNA 5 y L、无核酸酶灭菌水4. 6 y L; 其中，所述引物Mix含有： 序列为SEQ ID N0.9的10ym〇l/L猪传染性胸膜肺炎放线杆菌上游引物0.05 yL， 序列为SEQ ID NO. 10的10 y mol/L猪传染性胸膜肺炎放线杆菌下游引物0. 05 y L， 序列为SEQ ID NO. 11的10 ymol/L副猪嗜血杆菌上游引物0. 1 yL， 序列为SEQ ID NO. 12的10ymol/L副猪嗜血杆菌下游引物0. lyL， 序列为SEQ ID NO. 13的10 y mol/L猪肺炎支原体上游引物0. 1 y L， 序列为SEQ ID NO. 14的10 y mol/L猪肺炎支原体下游引物0. 1 y L， 序列为SEQ ID NO. 15的lOymol/L猪圆环病毒2型上游引物0. 05yL， 序列为SEQ ID NO. 16的10ymol/L猪圆环病毒2型下游引物0. 05yL， 序列为SEQ ID NO. 17的10 ymol/L猪繁殖与呼吸综合征病毒上游引物0. 1 y L， 序列为SEQ ID NO. 18的10 ymol/L猪繁殖与呼吸综合征病毒下游引物0. 1 y L， 序列为SEQ ID NO. 19的10 y mol/L猪瘟病毒上游引物0. 05 y L， 序列为SEQ ID NO. 20的10ymol/L猪瘟病毒下游引物0. 05yL， 序列为SEQ ID NO. 21的20ymol/L通用引物上游引物1 yL， 序列为SEQ ID NO. 22的20ymol/L通用引物下游引物lyL. 按如下步骤进行扩增：94°C 5 min;94°C 30 sec，56°C 30 sec，72°C 25 sec 循环 12 次；94°C 30 sec，5(TC 30 sec，72°C 25 sec 循环 30 次；72°C 5min; (3) 杂交：首先配制杂交液，包括杂交缓冲液7. 9 yL、PCR扩增产物8 yL、杂交阳性对 照0. 1 y L，混匀后95°C变性8min，冰上放置5min，然后用15 y L杂交液进行杂交； (4) 结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对 照，判定结果。
[0008] 本发明具有如下优点： (1)成功地构建了APP&HPS&Mhp&PCV2&PRRSV&CSFV鉴别检测基因芯片：本发明所制备 的基因芯片采用的各条筛选探针可与对应病原体目的基因进行特异性结合，杂交信号较强 且稳定。
[0009] (2)制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征：本发明建立了一种特异性好、灵 敏度高、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。
[0010] (3)检测基因芯片的构建，为混合感染病原的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效 的手段：为今后出入境动物检疫、肉制品检疫和相应疫病控制提供了技术保障。对满足进出 境动物检疫工作的需要，控制猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、 猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健 康发展具有十分重要的意义。
【附图说明】
[0011 ] 图1为芯片探针分布不意图； 图2为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌杂交结果； 图3为副猪嗜血杆菌杂交结果； 图4为猪肺炎支原体杂交结果； 图5为猪圆环病毒2型杂交结果； 图6为猪繁殖与呼吸综合征病毒杂交结果； 图7为猪瘟病毒杂交结果； 图8为六种病原核