一种鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株和基因4系野毒株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及荧光RT-PCR检测技术，具体地说，涉及一种能同时鉴别小反刍兽疫病 毒疫苗毒株和基因4系野毒株的荧光RT-PCR检测技术。
【背景技术】
[0002] 小反会兽疫（Peste des petits ruminants, PPR)是由副黏病毒科、麻疹病毒属的 小反会兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起的一种高度接触性传染 病，是危害养羊业最重要的疫病之一。该病主要感染绵羊、山羊和野生小反刍动物。小反刍 兽疫主要在中非、西非、东非、中东和南亚等地区流行。我国于2007年首先发现该病，随后 又有几次小规模暴发，但只局限在西藏阿里地区。到了 2013年新疆再次暴发该病，并随后 传播到国内大多数省份，给我国的养羊业造成巨大损失。
[0003] 根据N基因的遗传进化分析可以把小反刍兽疫病毒分为4个基因系，各种基因系 的分布呈现不同地域特征，其中以基因4系分布最为广泛。亚洲地区的流行毒株绝大多数 为基因4系。目前国内流行的毒株均为基因4系，而国内和世界上广泛使用的弱毒活疫苗 Nigeria75/1株为基因2系。
[0004] 由于小反刍兽疫的发病率和死亡率较高，为预防该病国内各省份普遍实行了采 用Nigeria75/1弱毒疫苗免疫的措施，并且加大了病原学监测力度。由于目前所使用的 Nigeria75/1疫苗是活毒疫苗，免疫动物后在一段时间内排出病毒，给该病的病原学监测 造成干扰。目前国家标准《小反刍兽疫诊断技术》中或世界动物卫生组织（0IE)的诊断手 册中使用的方法均为针对所有小反刍兽疫病毒毒株的检测方法，对病毒基因系的鉴别还需 要进一步测序分析，没有区分疫苗毒株与流行毒株的高通量快速诊断方法。因此，实现小反 刍兽疫病毒弱毒疫苗株与野毒株的鉴别检测，对于小反刍兽疫的防控工作具有重要的现实 意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题在于提供一种能在一个反应管中同时鉴别小反刍兽疫 病毒疫苗株和基因4系野毒株的一步法荧光RT-PCR检测方法。
[0006] 本发明提供用于鉴别小反刍兽疫病毒疫苗株和基因4系野毒株的引物对，包括上 游引物PPRV-A1和下游引物PPRV-A2，其序列分别为ACCGGYATAG AGGTAACATG YAATCC和 CYTGGCTCCT AAGTmTTT ATAACA(SEQ IDN0:2);其中 Y 代表 T 或 C。
[0007] 本发明提供一种用于检测小反刍兽疫病毒疫苗株核酸Real-time RT-PCR检测的 TaqMan 探针 PPRV-L2P，其核苷酸序列 SEQIDNo.3 为：CAGGCCTCCG AGCCATCCCC TAG，或其反 向互补序列 SEQIDNo. 4:CTAGGGGATG GCTCGGAGGC CTG。
[0008] 本发明还提供一种用于检测小反刍兽疫病毒基因4系野毒株核酸的TaqMan探针 PPRV-L4P，其核苷酸序列SEQIDNo.5为：CAGTCCCTTG AGTCGCCACC GAG，或其反向互补序列 SEQIDNo.6 为：CTCGGTGGCG ACTCAAGGGA CTG。
[0009] 用于检测基因4系野毒株探针PPRV-L4P的5'端标记FAM荧光基团，用于检测疫 苗株的探针PPRV-L2P端标记VIC荧光基团或HEX荧光基团。
[0010] 本发明还提供一种检测小反刍兽疫病毒疫苗株和基因4系野毒株的Real-time RT-PCR检测方法，是将上述引物组和探针加入到同一个反应管中进行检测。
[0011] 本发明的小反刍兽疫病毒疫苗株和基因4系野毒株Real-timeRT-PCR检测用引 物和TaqMan探针同时加入到一个反应管中；所用引物能扩增疫苗株和基因4系小反刍兽疫 病毒，疫苗株特异性TaqMan探针和基因4系特异性TaqMan探针分别标记不同的报告荧光 用以检测不同毒株。在Real-timeRT-PCR检测中，若在各自的荧光通道内产生与疫苗株或 基因4系相对应的特异性荧光曲线，则表示检测出该报告荧光所对应的小反刍兽疫病毒毒 株。本发明能在Real-timeRT-PCR检测中同时快速鉴别诊断小反刍兽疫病毒疫苗株和基 因4系野毒株，具有结果可靠、准确灵敏、操作简单、成本低和节约时间等优点，特别适合在 小反刍兽疫病原学监测和疫情诊断中应用。
【附图说明】
[0012] 图1为同时检测小反刍兽疫病毒疫苗株和野毒株Real-timeRT-PCR方法的特异 性试验
[0013]图2为小反刍兽疫病毒鉴别荧光RT-PCR方法对野毒株的敏感性试验
[0014] 图3鉴别荧光RT-PCR对临床样品的检测结果。A为野毒株探针检测结果，B为疫 苗株探针检测结果。
【具体实施方式】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行详细说明。应当理解，本处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0016] 本发明通过对小反刍兽疫病毒基因组序列进行比对分析，选取了疫苗株与基因4 系野毒株的差异SNP位点区域进行引物和TaqMan探针的设计。用于检测基因4系野毒株 探针PPRV-L4P的5'端标记FAM荧光基团，用于检测疫苗株的探针PPRV-L2P5'端标记VIC 荧光基团或ffiX荧光基团，二种探针的3'端均标记BHQ1荧光淬灭基团。引物和探针序列 如下：
[0017]
[0018] 将上述引物、探针序列组合后建立检测小反刍兽疫的疫苗株和野毒株的 Real-timeRT-PCR检测方法。
[0019] 小反刍兽疫病毒疫苗株和野毒株Real-timeRT-PCR鉴别检测方法采用以下步 骤：
[0020] (1)制备待测模板。采用Trizol核酸提取试剂或其它商品化试剂盒提取各种类型 待检样品中的病毒核酸。
[0021] (2)反应体系的配制。参照 Superscript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System说明书进行反应体系的配制，采用25yl反应体系。其中包括2XReaction Mix 12. 5 y 1，上游引物 PPRV-A1 (10 yM) 1 y 1，下游引物 PPRV-A2(10 yM) 1 y 1，探针 PPRV-L2P(10 yM)0.5 yl，探针 PPRV-L4P(10 yM)0.5 yl，Superscript IIII RT/Platinum Taq Mix 0? 5 y 1，ROX 0? 5 y 1，待测 RNA 模板 3 y 1，用无 RNase 的水足体积至 25 y 1。
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