蛋白酶体抑制剂与细胞自噬激活剂联合在胆管癌治疗中的应用
【技术领域】
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[0001]本发明涉及医药技术领域，具体涉及在胆管癌中检测PTEN表达的方法，PTEN过表达非增值型腺病毒载体的构建和包装，以及蛋白酶体抑制剂和细胞自噬/溶酶体激活剂联合在PTEN缺失型胆管癌治疗中的运用。
【背景技术】
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[0002]胆管癌(carcinoma of bile duct，简称CC)指源于肝外胆管包括肝门区至胆总管下端的胆管的恶性肿瘤，是原发性肝癌中的一种，占原发性肝癌比例约为10% ;在临床中表现为潜伏期长，恶性程度高，放化疗抵抗，预后差等特点；流行病学显示近年来胆管癌的发病率持续上升，给整个医疗卫生事业带来极大的挑战。随着研究的深入，人们对参与胆管癌发生发展的分子机制也有了更进一步的认识。基因组测序显示，部分CC肿瘤组织中3p, 4q, 6q, 9p, 9q, 13q, 14q, 8p, 17p,及21q发生缺失，Iq和7p有增加。外显子测序显示P53，KRAS, SMAD4，IHD等是在胆管癌中常常突变或激活的基因JAK_Stat，MAPK,TGFP-SMAD, TOGF信号通路在胆管癌中经常被激活或放大，促进了胆管癌发生发展；这些分子机制的探索为胆管癌的诊治提供了新的思路(Ong, C.K.et al.Exome sequencing ofliver fluke-associated cholang1carcinoma.Nat Genet, 2012，44，690-693)。目前，对于胆管癌的治疗除手术外，化疗是最主要的方式，使用药物有吉西他滨(GEM)和顺铂(DDP)等，但它们都缺乏明确的分子分型靶标，为肿瘤的治疗带来困难。
[0003]PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，即MMAC1)是一个重要的抑癌基因，其全称是人10号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物，其核苷酸Genebank ID号为5728。1997年被两个独立的课题组发现和确认，是继P53之后发现的最重要的抑癌基因，在多种肿瘤中存在突变或缺失(Li, J.et al.PTEN, a putative proteintyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer.Science, 1997，275，1943-1947)。PTEN 通过自身脂质磷酸酶活性，拮抗 PI3K-Akt_mT0R信号通路，调控细胞多种生理进程，包括:存活，增殖，能量代谢，细胞骨架构建以及细胞间相互识别(Song, M.S., Salmena, L.&Pandolfi, P.P.The funct1ns and regulat1nof the PTEN tumour suppressor.Nat Rev Mol Cell B1l, 2012，13，283-296)。因此，调节PTEN表达和功能的机制，在肿瘤发生发展中尤其重要。越来越多的研究发现肿瘤中PTEN缺失与否直接关系着化疗药物的敏感性，有文章指出PTEN的缺失会导致肿瘤细胞基因组不稳定，这种不稳定性恰好适用于某些小分子抑制剂或化疗药物，从而可以实现以 PTEN 为基础的个性化治疗(Mason, J.M.et al.Funct1nal characterizat1n ofCF1-400945, a Polo-like kinase 4inhibitor, as a potential anticancer agent.Cancer Cell, 2014，26，163-176)。
[0004]蛋白酶体(proteasome)是在真核生物和古菌中普遍存在的结构，主要作用是降解细胞不需要的或受到损伤的蛋白质。抑制蛋白酶体的功能将引起蛋白降解的紊乱，导致细胞出现病理性变化，严重时会引起细胞死亡。目前，临床上应用蛋白酶体抑制剂Bortezomib 治疗多发性骨髓瘤，取得了 一定的疗效(Ria, R., Reale, A.&Vacca, A.Novelagents and new therapeutic approaches for treatment of multiple myeloma.WorldJ Methodol, 2014，4，73-90)。
[0005]细胞自卩蜜(autophagy)是由Ashford和Porter在1962年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自■体(autophagosome)，与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。细胞自噬的现象在机体的生理或病理过程均能观察到，所起的作用需要进一步阐明。有研究报道mT0R(Mammalian target of rapamycin)的抑制剂Rapamycin，CC-223，AZD8055等可以激活细胞自噬，抑制HCC肿瘤细胞系增殖迀移等生物学过程，目前该类部分药物已进入二期临床试验。这提示我们干预自噬，打破细胞的稳态，可以用于疾病的治疗(Ashworth, R.E.&ffu, J.Mammalian target of rapamycin inhibit1n in hepatocellularcarcinoma.World J Hepatol, 2014，6，776-782)。
[0006]但不论是蛋白酶体的抑制剂，或是细胞自噬的调节剂，在临床上应用均较少。它们都是针对细胞最基本的生命过程，治疗的靶向性较差；已经上市的药物适应症较为单一，目前还不能广泛运用。因此，寻找新的适应症，根据分子分型进行靶向性治疗，是这一类药物急需的。
【发明内容】
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[0007]本发明的目的在于提供一种以PTEN为靶标的胆管癌个性化治疗方案；本发明的另一目的在于提供蛋白酶体抑制剂和细胞自噬激活剂新的医药用途，即联合蛋白酶体抑制剂和细胞自噬/溶酶体激活剂可以用于治疗PTEN缺失的胆管癌肿瘤。
[0008]为了更好地分析胆管癌的预后风险因素，本发明提供了 PTEN在127例胆管癌石蜡组织切片中的免疫组化评分结果，用于评估胆管癌预后不良。本发明发现，在这127例胆管癌患者的肿瘤组织中有63例样本(50% )PTEN表达为阴性，表明PTEN在胆管癌中缺失严重。结合患者的临床统计资料，以Kaplan-Meier法比较PTEN阴性/阳性表达的术后无瘤生存时间(DFS)和总体生存时间(OS)，均体现出显著差异，PTEN阳性的患者预后存活更好。
[0009]本发明的第一方面，提供了人10号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)可以作为肝内胆管癌评估预后的分子标记物。
[0010]进一步地，本发明提供了 PTEN在制备胆管癌预后评估试剂或试剂盒中的应用。
[0011]所述的试剂为检测生物样品中PTEN表达量的试剂；所述的试剂盒包含检测生物样品中PTEN表达量的试剂。
[0012]所述的检测生物样品中PTEN表达量的试剂，选自:对PTEN具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物等。
[0013]本发明的第二方面，提供了人10号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)在制备治疗胆管癌药物中的应用。
[0014]所述的药物为提高PTEN表达量的的试剂。
[0015]所述的能够提高PTEN表达量的的试剂，选自:PTEN分子、PTEN分子作为活性物质的组合物，或含有PTEN分子的载体等。
[0016]所述的PTEN分子为PTEN基因或PTEN蛋白。
[0017]所述的含有PTEN分子的载体，可以是PTEN过表达的病毒载体，例如PTEN过表达的腺病毒载体，或PTEN过表达的慢病毒载体等。
[0018]本发明提供了一种PTEN过表达腺病毒载体在制备治疗胆管癌药物中的应用；特别是针对PTEN缺失的胆管癌肿瘤。
[0019]所述的PTEN过表达腺病毒载体的构建方法为:使用限制性内切酶获得线性化载体；通过PCR扩增获得PTEN cDNA，通过酶切获得与表达载体相同的粘性末端；在连接酶的作用下，将cDNA与线性化的载体相连接，筛选连接成功的质粒并进行测序鉴定。
[0020]本发明提供了在胆管癌细胞系中过表达PTEN后的芯片分析结果，所筛选出的信号通路可以作为药物靶点