用于鉴定籼稻品种间杂种弱势基因的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物分子标记辅助选择领域，具体涉及用于鉴定籼稻品种间杂种弱势 基因的分子标记，以及该分子标记的用途。
【背景技术】
[0002] 杂种弱势是指表现正常的两个物种间或者同一物种不同品种间杂交能够产生正 常可育的种子，但这些种子的生长发育发生了缺陷，主要表现为生长迟缓、植株矮小、叶片 黄化以及组织坏死等表型。杂种弱势是生殖隔离的一种形式，在水稻中通常出现在籼粳 杂交或野生稻与栽培稻的杂交中，通常受两对以上互作基因控制（Chen et al, Molecular plant, 2013, 6(3) :716-728)。目前已经定位和克隆了 10多个水稻杂种弱势相关基因，分 别位于第1、4、7、10和11染色体上，且这些基因大多位于抗病基因附近或者具有抗病基因 的典型结构（Tsutomu Kuboyama, Rice, 2009, 2:93-103 ;Ichitani 等? Rice, 2011，4:29-38 ; Chen等? Nature communication, 2014, 5:3357)。植物免疫系统的多样化可产生负面的结 果，这些不同的免疫因子间的上位互作可导致杂种弱势或杂种坏死的产生（Bombile S，B〇ta ny. 2009, 87:1013-1022)。
[0003] 广东省农业科学院水稻研究所研究发现携带抗稻瘟病基因Pil材料与优质保 持系或不育系泰丰B/A杂交时，其杂种匕代在广州气温较低的早季种植表现杂种弱势， 这也是首次报道籼稻品种间杂种弱势；而当这些？ :代材料在气温较高的晚季则又表现 杂种优势。研究这种受温度诱导的杂种弱势现象也有助于了解杂种优势的机理，从而更 好地利用杂种优势。利用抗病材料RGD-7S与泰丰B创建的群体精细定位了来自RGD-7S 的、位于第11染色体上与抗稻瘟病基因Pil连锁的杂种弱势新基因Hw3(Fu等.，PL 〇S one,2013,8:e73886)〇
[0004] 抗稻瘟病基因Pil是目前水稻生产上应用较多的广谱抗病基因之一，该抗病基因 与杂种弱势基因Hw3紧密连锁，这就增加了育种材料携带该杂种弱势基因的风险。目前，这 种受温度诱导的籼稻品种间杂种弱势只能通过杂交且仅在温度较低时才出现，这就增加了 杂交稻育种中出现杂种弱势的风险，降低了育种效率。因此，利用分子标记对育种材料中的 杂种弱势基因进行早期筛选，是降低出现杂种弱势的风险，提高育种效率的有效途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种用于鉴定籼稻品种间杂种弱势基因的分子标记。该分 子标记可用于对杂交稻亲本材料中的杂种弱势基因进行筛选，以避免在杂交稻配组中出现 杂种弱势，提高强优势杂交稻新组合的选配效率。
[0006] 本发明另一目的在于提供用于扩增上述分子标记的PCR引物对。
[0007] 本发明第三目的在于提供用于检测籼稻品种间杂种弱势基因的试剂盒。
[0008] 本发明第四目的在于提供上述分子标记在籼稻品种间杂种弱势基因鉴定上的应 用。
[0009] 本发明第五目的在于提供上述引物对在籼稻品种间杂种弱势基因鉴定上的应用。
[0010] 本发明第六目的在于提供利用上述分子标记快速鉴定籼稻品种间杂种弱势基因 材料的方法。
[0011] 本发明第七目的在于提供利用上述分子标记培育水稻品种的方法。
[0012] 实现本发明的技术方案如下：
[0013] 本发明用于鉴定籼稻品种间杂种弱势基因的分子标记，命名为M12,所述的分子标 记由SEQ ID No: 1所示的核苷酸序列组成。
[0014] 上述分子标记中所述的杂种弱势基因是指Hw3,该基因位于位于水稻第11染色体 长臂上。
[0015] 用于扩增上述分子标记的引物对，命名为ID1112,所述的引物对由SEQID No:2和 SEQID N〇:3所示的核苷酸序列组成；所述的引物对为：
[0016]M12-F :5'AGAGAGAGGGGGAAGAGAGA 3'（SEQ ID No:2)，
[0017] M12-R :5'GGGAATGTTTCAGGTGCGAC 3'（SEQ ID No:3)。
[0018] 用于鉴定籼稻品种间杂种弱势基因的试剂盒，包括由SEQIDN〇:2和SEQIDN〇:3 所示的核苷酸序列组成的引物对。
[0019] 上述分子标记在籼稻品种间杂种弱势基因鉴定上的应用。
[0020] 上述引物对在籼稻品种间杂种弱势基因鉴定上的应用。
[0021] 上述应用中所述的杂种弱势基因是指Hw3,该基因位于位于水稻第11染色体上。
[0022] 利用上述分子标记快速鉴定籼稻品种间杂种弱势基因材料的方法，包括以被鉴定 籼稻材料的总DNA为模板，以SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的核苷酸序列为引物进行 PCR扩增，电泳，PCR扩增产物中具有分子标记M12的，即为带有籼稻品种间杂种弱势基因的 材料。
[0023] 上述方法中所述的PCR扩增，其PCR反应体系为：基因组DNA(10ng/ul)2ul，10X PCR buffer 2.5ul，sdNTPs(2.5mM)2ul，引物（mixed)(5pM)2ul，Taq 酶（5U/ul)0.2ul， ddH2017. 3ul;其 PCR 反应程序为：94°C 5min ;94°C 30sec, 55°C 30sec, 72°C 30sec, 30 个循 环；72°C lOmin。
[0024] 利用上述分子标记培育水稻品种的方法，包括以从杂交后代或自交后代的幼苗提 取的基因组DNA为模板，以SEQ ID N〇:2和SEQ ID如:3所示的核苷酸序列为引物进行卩0? 扩增，电泳，淘汰具有分子标记M12的材料，保留不带分子标记M12的材料进入下一代，直至 育成新的不含杂种弱势基因的水稻品种。
[0025] 本发明具有的优点和有益效果：（1)、本发明分子标记与杂种弱势基因Hw3紧密连 锁，为共分离分子标记，为快速准确鉴定杂种弱基因Hw3的存在与否提供了有力工具。（2)、 本发明分子标记为共显性分子标记，可以直接对杂种弱势基因的基因型进行鉴定，可以准 确判断Hw3基因位点是杂合还是纯合，选择准确性高，可靠性强。（3)、本发明分子标记不受 时间和环境条件限制，可以在早期对Hw3基因进行鉴定。（4)、本发明鉴定方法简单，可以对 材料进行大规模鉴定，省时省力，成本低。
【附图说明】
[0026] 图1.本发明以M12-F和M12-R为引物对不同材料进行PCR扩增的电泳图谱；其中 1为RGD-7S，2为泰丰B。
[0027] 图2.本发明以M12-F和M12-R为引物对不同材料进行PCR扩增的电泳图谱；其 中1为BL122, 2为RGD-7S，3为荣丰B，4为吉丰B，5为安丰B，6为155B，7为广恢998,8为 1775,9 为 T555,10 为 T553,11 为 D638,12 为 D466,13 为抗 998,14 为 D618,15 为 R3922,16 为 D508,17 为蜀恢 527,18 为 V6038,19 为广恢 290, 20 为 R290G，21 为泰丰 B。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1籼稻品种间杂种弱势基因的分子标记的筛选
[0029] 按照如下方法进行：
[0030] (1)、根据产生杂种弱势的亲本材料RGD-7S和泰丰B的全基因组重测序结果， 并结合对杂种弱势基因Hw3的定位结果（Chr. 11:26689171-26829741，基于日本晴序列 IRGSP-1. 0 版本）（Fu 等，PLoSone, 2013, 8:e73886)，选择在RGD-7S和泰丰B之间在第 11 染色体长臂的候选区间内发生了大于10个碱基插入/缺失的位点（见表1)，利用primerf 软件基于基因组重测序结果设计了 5对引物（见表2)。
[0031] 表1基于基因组重测序结果在Hw3基因候选区间内找到的INDEL位点
[0032]
[0033] 表2基于表1中的INDEL位点设计的相应引物
[0034]
[0035] (2)、以R⑶-7S和泰丰B的基因组DNA为模板，以设计的这5个分子标记的相应 引物（见表2)进行PCR扩增。其中PCR反应体系为：基因组DNA模板（10ng/ul)2ul，10X PCR buffer 2.5ul，sdNTPs(2.5mM)2ul，引物（mixed)(5pM)2ul，Taq 酶（5U/ul)0.2ul， ddH2017. 3ul;其反应程序为：94°C 5min ;94°C 30sec, 55°C 30sec, 72°C，30sec, 30 个循环； 72°C lOmin。PCR扩增完毕后加入2. 5ul上样缓冲液，用3%的琼脂糖凝胶在150V电压下电 泳1小时，用