一种利用毕赤酵母表达系统生产云芝免疫调节蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药，特别是一种利用毕赤酵母表达系统生产云芝免疫调节蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]真菌免疫调节蛋白(fungal immunomodulatory proteins，FIPs)是从食药用真菌菌体中发现的一种新型生物活性小分子蛋白质。该蛋白的发现，打破了传统上人们认为“真菌多糖是食药用真菌主效活性成分”的观点，激发了人们从食药用真菌中寻找新型活性成分的兴趣。目前从食药用真菌中获得了 8种真菌免疫调节蛋白:LZ-8、FlP-fve、FIP-vvo,FIP-gts、FIP-gm1、FIP-gja、FlP-gsi 和 FlP-tvc，分别来自灵芝 Gandenmlucidim、松杉灵_芝小抱子灵芝(?.microsporum、U_m G.japnoicum、繁芝 G.sinense、各与\裔 Flaimulinavelutipes、卑裔 Volvariellavolvacea^-W7X2! Trametes versicolor,它们组成了一个新的蛋白质家族。FIPs成员间具有相似氨基酸序列和结构，由110-114个氨基酸组成，具有较高的同源性，达60-100%，有47个氨基酸完全一致，并有4处保守区域，与行使功能有直接关系，显示了真菌免疫调节蛋白在分子进化上的保守性。
[0003]不同来源的真菌免疫调节蛋白之间有相似的免疫学功能，例如能够凝集红细胞，促进淋巴细胞增殖，抑制机体多种过敏性反应，降低抗体产生，降低小鼠足垫水肿和移植组织的排斥反应，并促进T淋巴细胞分泌多种细胞因子(白介素-2、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ等)。另外，真菌免疫调节蛋白具有抗肿瘤活性，对肺癌、肝癌、胃癌等多种肿瘤细胞具有抑制生长或者直接杀伤作用，并且无毒副作用。因此真菌免疫调节蛋白是一种极具开发成免疫调节药物潜力的蛋白质，可以用于肿瘤和免疫系统疾病的治疗。
[0004]云芝免疫调节蛋白FlP-tvc是从中国传统药用真菌云芝(7: versicolor)发现的一种真菌免疫调节蛋白。FlP-tvc由111个氨基酸残基组成，分子量为12440Da，等电点/λ[为4.81，不含组氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸(Li et al.2012，Pro ExpPurif, 82:339-344)。FlP-tvc能够凝集红细胞；是一种有丝分裂原，具有促进小鼠脾淋巴细胞增殖的作用；能够诱导淋巴细胞分泌白介素IL-2、干扰素IFN-γ、肿瘤坏死因子TNF-α等细胞因子；同时具有抑制肺癌、肝癌等肿瘤细胞生长的生物活性。因此，FlP-tvc是一种极具开发潜力的药用蛋白质。
[0005]从云芝子实体中提取天然免疫调节蛋白的产率很低，约为3mg/kg干重，因此应用基因工程将FlP-tvc基因转入到相应的宿主中表达获得大量重组蛋白，从而进行开发应用是非常有价值和前景的。Li等(2012，Pro ExpPurif, 82: 339-344)报道FlP-tvc在大肠杆菌BL21 (DE3)中的重组表达，但仅有20%的可溶性重组蛋白，大部分以包涵体的形式存在。尽管原核生物细菌表达具有简单快速的特点，但是由于对目的蛋白形成大量的包涵体，并且蛋白质的高级修饰不完善、生物学活性低于天然蛋白等缺点而不适于大规模工业化生产。
[0006]毕赤酵母表达系统是迄今为止最为成功的高效表达系统，其遗传背景相对清楚，外源基因可稳定遗传，表达产量高，成本低，特别适合表达小分子活性蛋白。另外，作为真核表达系统，毕赤酵母具有类似其他动植物细胞的翻译后修饰功能，如蛋白质折叠、糖基化和磷酸化等。由于毕赤酵母表达系统兼有原核和真核表达系统的优点，在基因工程领域中得到日益广泛的应用，同时考虑云芝免疫调节蛋白FlP-tvc的特点和其他表达系统的不足，用该系统表达云芝免疫调节蛋白FlP-tvc可以作为一种理想的选择和途径。但至今还未见云芝免疫调节蛋白FlP-tvc在毕赤酵母中成功表达进行大量生产的报道。
【发明内容】
[0007]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种利用毕赤酵母表达系统生产云芝免疫调节蛋白的方法，可有效解决云芝免疫调节蛋白的制备问题。
[0008]本发明解决的技术方案是，包括以下步骤:
(1)按照毕赤酵母密码子偏好性合成云芝免疫调节蛋白FlP-tvc基因的核苷酸序列SEQ ID N0.1 ；
所述的毕赤酵母为毕赤酵母菌细胞GS115 ；
(2)利用限制性内切酶酶切步骤(I)中合成的云芝免疫调节蛋白FlP-tvc与表达质粒载体X，构建重组表达质粒X-FIP-tvc，方法是，将合成的基因序列与质粒载体Z利用限制性内切酶进行酶切，回收目的片段，利用T4 DNA连接酶将的酶切片段与质粒载体i酶切片段连接，得到重组表达质粒X-FIP-tvc,转化到大肠杆菌DH5 α中进行扩增；
所述的表达质粒载体X为组成型表达质粒载体pGAPZ a A或诱导型表达质粒载体pPICZa A ；
(3)利用限制性内切酶对重组表达质粒载体X-FIP-tvc进行线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞，应用含抗生素的平板和PCR方法筛选出组成型阳性转化子或诱导型阳性转化子；
(4)表达重组蛋白rFIP-tvc毕赤酵母菌株的发酵筛选:从步骤(3)发酵筛选出的组成型阳性转化子在YPD液体培养基中培养3-5d后，发酵上清液以SDS-PAGE检测蛋白质表达量，筛选出组成型分泌表达rFIP-tvc的毕赤酵母重组菌株；或从步骤(3)筛选出的诱导型阳性转化子在BMSY培养基中培养2-4d，菌液加入甲醇进行重组蛋白的诱导表达，诱导3-7d，发酵上清液以SDS-PAGE检测蛋白质表达量，筛选出诱导型高水平分泌表达rFIP-tvc的毕赤酵母重组菌株；
(5)毕赤酵母重组菌株发酵上清液中分离纯化云芝免疫调节蛋白FlP-tvc，将步骤(4)筛选出的rFIP-tvc的毕赤酵母重组菌株进行发酵培养或诱导表达3-7d，发酵上清液用硫酸铵进行沉淀，沉淀用平衡缓冲液进行溶解并用平衡缓冲液进行透析24-48h，将透析后的蛋白样品上平衡缓冲液透析后的N1-NTA层析柱进行亲和交换层析，获得纯化的重组蛋白rFIP-tvc,以真空冷冻干燥或喷雾干燥等方法制得云芝免疫调节蛋白FlP-tvc固体粉末。
[0009]本发明成本低、周期短、技术上容易，适于工业化生产，纯度高。
【附图说明】
[0010]图1为本发明构建的表达重组云芝免疫调节蛋白rFIP-tvc组成型质粒表达载体pGAPZ a A-FIP-tvc 的示意图。
[0011]图2为本发明构建的表达重组云芝免疫调节蛋白rFIP-tvc诱导型质粒表达载体pPICZ a A-FIP-tvc 的示意图。
【具体实施方式】
[0012]以下结合附图和具体情况对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0013]本发明在具体实施中，包括以下步骤:
(1)按照毕赤酵母密码子偏好性合成云芝免疫调节蛋白FlP-tvc基因的核苷酸序列SEQ ID N0.1 (已在《Li et al.2012，Pro ExpPurif,82: 339-344》中公开)；
所述的毕赤酵母为毕赤酵母菌细胞GS115 (市售产品，如ACCC中国农业微生物菌种保藏管理中心、ISF中国农业科学院土壤肥料研究所或CGMCC普通微生物菌种保藏管理中心保藏的菌株)；
(2)利用限制性内切酶酶切步骤(I)中合成的云芝免疫调节蛋白FlP-tvc与表达质粒载体X，构建重组表达质粒X-FIP-tvc，方法是，将合成的基因序列与质粒载体Z利用限制性内切酶进行酶切，回收目的片段，利用T4 DNA连接酶将的酶切片段与质粒载体i酶切片段连接，得到重组表达质粒X-FIP-tvc,转化到大肠杆菌DH5 α中进行扩增；
所述的表达质粒载体X为组成型表达质粒载体pGAPZ a A或诱导型表达质粒载体pPICZα A ；
(3)利用限制性内切酶对重组表达质粒载体X-FIP-tvc进行线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞，应用含抗生素的平板和PCR方法筛选出组成型阳性转化子或诱导型阳性转化子；
(4)表达重组蛋白rFIP-tvc毕赤酵母菌株的发酵筛选:从步骤(3)发酵筛选出的组成型阳性转化子在YPD液体培养基中培养3-5d后，发酵上清液以SDS-PAGE检测蛋白质表达量，筛选出组成型分泌表达rFIP-tvc的毕赤酵母重组菌株；或从步骤(3)筛选出的诱导型阳性转化子在BMSY培养基中培养2-4d，菌液加入甲醇进行重组蛋白的诱导表达，诱导3-7d，发酵上清液以SDS-PAGE检测蛋白质表达量，筛选出诱导型高水平分泌表达rFIP-tvc的毕赤酵母重组菌株；
(5)毕赤酵母重组菌株发酵上清液中分离纯化云芝免疫调节蛋白FlP-tvc，将步骤(4)筛选出的rFIP-tvc的毕赤酵母重组菌株进行发酵培养或诱导表达3-7d，发酵上清液用硫酸铵进行沉淀，沉淀用平衡缓冲液进行溶解并用平衡缓冲液进行透析24-48h，将透析后的蛋白样品上平衡缓冲液透析后的N1-NTA层析柱进行亲和交换层析，获得纯化的重组蛋白rFIP-tvc,以真空冷冻干燥或喷雾干燥等方法制得云芝免疫调节蛋白FlP-tvc固体粉末。
[0014]步骤(I)中所述的按照毕赤酵母密码子偏好性合成云芝免疫调节蛋白