具有促进海参生长和抗逆作用的琼胶寡糖及其制法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种具有促进海参生长和抗逆作用的琼胶寡糖及其制法和应用。
【背景技术】
[0002]琼胶是从红藻细胞壁中提取的一种多糖，主要由琼胶糖和琼脂胶两种多糖组成，虽然琼胶作为天然多糖有很多用途，但是由于其粘度高，溶解性低，限制了其在食品、医药等方面的应用。琼胶降解后产生一定分子量和聚合度的琼胶寡糖，降解方式一般分三种:物理法、化学法和酶解法。物理法和化学法降解效果较好，但其降解条件难控制，产物不均一，限制了其应用。相比之下，海参是一种高蛋白低脂肪的海洋食品，且具有人体所必须的钙、铁、锌、猛和镁等微量元素。由于海参的保健酶法具有高效性，产物易控制，设施简单、耗能低等优点。
[0003]海参是一种高蛋白低脂肪的海洋食品，且具有人体所必须的钙、铁、锌、猛和镁等微量元素。由于海参的保健和药用功能显著，随着海参需求量不断增加，出现大规模的海参养殖。大规模养殖过程造成各种病害，开发利用具有无污染、无残留的免疫增强剂，来提高动物机体抵抗能力，预防动物疾病促生长的新型饲料添加剂已经成为水产养殖业的必然趋势。
[0004]琼胶酶可将琼胶降解为琼胶寡糖。寡糖因聚合度不同，生物活性也不尽相同，如抗病毒、抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等。这些特性使得琼胶寡糖在海洋药物、保健品及化妆品等方面具有潜在的应用价值。琼胶寡糖对海参抗逆性与促生长作用还未见报道，且活性机理尚不完全清楚，有待于进一步研究。
【发明内容】
[0005]本发明为解决上述问题，第一个目的是提供一种具有促进海参生长和抗逆作用的琼胶寡糖的制备方法及其本身。本发明的另一个目的是提供利用上述琼胶寡糖在饲料添加剂中的应用。
[0006]本发明的技术方案如下:一种具有促进海参生长和抗逆作用的琼胶寡糖的制备方法，通过以下步骤实现:
[0007](I)粗酶液制备:将菌株(Pedobacter sp:QR)接种到液体培养基中，于30°C培养20h，制得种子液，以1%的接种量进行传代，于25-30°C震荡培养20h，转速150r/min ;待菌株稳定后，将发酵液于4°C条件下4000r/min离心30min，取上清液即为粗酶液；
[0008](2)琼胶寡糖制备:将浓度为0.4%的琼胶与粗酶液按体积比为1:1混合，于35-40°C反应20h，4000r/min离心lOmin，充分降解琼胶寡糖，将上清液经旋转蒸发、浓缩后进行冷冻干燥，得到粗寡糖，将粗寡糖纯化、干燥最终获得琼胶寡糖粉末。
[0009]作为优选，所述的液体培养基为:蛋白胨3g/L，氯化钠20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸亚铁0.0lg/L，硝酸钠0.25g/L，琼脂2g/L，pH为6.8。
[0010]所述的琼胶寡糖降解菌株QR分离自中国辽宁省大连市开发区海贝广场海域的海泥，经生理生化及16SrDNA鉴定，该菌株属于土地杆菌属(Pedobacter)，命名为Pedobactersp:QR0
[0011]所述的琼胶寡糖降解菌已于2015年6月16日提交保藏，具体保藏信息如下:
[0012]保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
[0013]保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；
[0014]保藏日期:2015年6月16日；
[0015]保藏编号:CGMCCN0.10828。
[0016]所述的琼胶寡糖降解菌株QR生理化特性为:乳白色菌落、菌落表面不透明、革兰氏阴性、杆状细菌、氧化酶阳性，最适生长温度20°C -40°C，最适氯化钠浓度3% -7%。
[0017]按照本发明所述的制备方法获得的琼胶寡糖平均聚合度为5，平均相对分子量为861。
[0018]本发明还要求保护利用该琼胶寡糖在饲料添加剂中的应用:
[0019](I)将制得的琼胶寡糖配合基础饲料饲喂海参，能够提高海参的抗逆作用。
[0020](2)将制得的琼胶寡糖配合基础饲料饲喂海参，能够提高海参的增长率，促进海参生长。
[0021]本发明的有益效果是:本发明利用筛选到的海洋菌株Pedobacter sp:QR分泌的胞外酶降解琼胶，得到琼胶寡糖，具有高效性，产物易控制、设施简单、耗能低等优点，该琼胶寡糖能够促进海参生长和提高海参抗逆能力，增加其抗逆性和免疫机能，显著促进海参生长，服用添加该寡糖饵料的海参生长状态较好，刺坚挺，身圆润，本发明所得琼胶寡糖为开发新型饲料添加剂和免疫增强剂奠定基础，是理想的海参饵料添加剂。
【附图说明】
[0022]图1为琼胶寡糖薄层层析分析结果；
[0023]图2为琼胶寡糖对海参抗逆生长情况；
[0024]图3为琼胶寡糖对海参生长促进情况。
【具体实施方式】
[0025]下面以具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。
[0026]实施例1琼胶寡糖降解菌(Pedobacter sp:QR)的选育
[0027]1.菌株的筛选
[0028]取适量海泥，用无菌生理盐水充分涮洗，吸取冲洗液于锥形瓶中，震荡并将其按比例稀释至不同浓度梯度进行稀释涂布，通过涂板法将10 2?10 6的稀释液均匀涂布于以琼胶为唯一碳源的固体培养基上，将涂好的平板置于30°C恒温培养箱中培养，48h后，观察固体培养基上菌株周围是否出现凹陷，以卢戈氏碘液染色是否出现透明圈，挑取固体培养基上出现凹陷且有透明圈的菌株进行分离纯化，如图1所示，经16SrDNA测序及生理生化实验鉴定后属于土地杆菌属，现命名为Pedobacter sp:QR。
[0029]固体筛选培养基:蛋白胨0.3g/L，酵母膏0.3g/L，琼脂2g/L, NaCll.5g/L，FeSO4.7H20 0.001g/L，pH 为 6.8。
[0030]2.琼胶寡糖的制备
[0031](I)粗酶液的制备
[0032]将菌株QR接种到液体培养基中，于30°C培养20h，制得种子液，以I %的接种量进行传代，于30°C震荡培养20h，转速150r/min ;待菌株稳定后，将发酵液于4°C条件下4000r/min离心30min，取上清液即为粗酶液；
[0033]液体培养基:蛋白胨3g/L，氯化钠20g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸亚铁 0.01g/L,硝酸钠 0.25g/L，琼脂 2g/L，pH 为 6.8。
[0034]将粗酶液与琼胶底物进行反应，进行酶活测定采用DNS法并做适当改进。反应体系为Iml粗酶液+Iml底物(0.4%琼胶)+2mlDNS，以灭活的菌液做对照。酶活定义为每分钟产生Iumol还原糖所需的酶量。测得该菌所产酶为0.53U
[0035](2)琼胶寡糖制备:向浓度为0.4%的琼胶底物中加入体积比1:1的粗酶液，于35-40°C反应20h，4000r/min离心lOmin，以除去未降解的多糖，其上清液经70°C旋转蒸发进行减压浓缩，将浓缩后的液体进行喷雾干燥得到粗琼胶寡糖，将粗琼胶寡糖纯化、干燥最终获得琼I父寡糖粉末；
[0036]对琼胶寡糖进行总糖和还原糖含量测定，总糖测定方法采用硫酸-苯酚法，还原糖含量测定采用DNS法，以半乳糖作为标准品，经计算得出琼胶寡糖的平均聚合度为5，平均相对分子质量为861。
[0037]经薄层层析鉴定结果如图1所示:左侧点I为葡萄糖标准品，右侧点2为琼胶寡糖，从图1可得出琼胶寡糖分子量分布情况，薄层层析板上显示两个清晰的寡糖聚合点，分子量大小不等，分离清晰，无拖尾现象无拖尾现象。
[0038]实施例2琼胶寡糖对海参生长情况的影响<