一种提高产那西肽的活跃链霉菌突变几率的诱变方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提高产那西肽的活跃链霉菌突变几率的诱变方法，特别涉及利用 低能离子束提高活跃链霉菌突变几率的诱变方法，属于物理诱变技术领域。
【背景技术】
[0002] 那西肽（Nosih印tide)含丰富的硫元素，属多肽类抗生素，主要由活跃链霉菌产 生；对革兰氏阳性菌有良好的抑制作用，通过与23SRNA和核糖体蛋白L11组成的复合体紧 密结合，从而抑制延长因子活性和GTP的水解，最终抑制了蛋白质的合成，使细菌的生长受 到抑制。那西肽由于其在肠道中溶解度低，不容易被动物吸收，因而可以在肠道内保持较高 的药物浓度，它具有用量低、抑菌范围广、动物体内不残留等特点，可明显促进鸡、猪、鱼等 动物的生长，因此是一种理想的新型非吸收性动物饲料添加剂。
[0003] 目前，许多国家和地区都在使用那西肽。国内的多家企业和科研院所对那西肽的 菌种选育及发酵工艺优化方面做了大量工作，但发酵水平较低，作为水平提高关键因素的 菌种仍有很大的提升空间。
[0004] 近年来离子束生物技术在微生物诱变育种的应用越来越广泛，低能离子注入作为 一种新的诱变源成果是非常显著的，低能离子是指能量在10 4KeV-105KeV之间的离子，它是 相对于传统辐射生物学中106KeV-109KeV而言的，能够引起靶物质原子移位和重排，使细胞 表面产生刻蚀和穿孔，并能影响和改变细胞电性等现象，从而使菌体产生突变。
[0005] 利用低能离子注入技术诱变时的主要技术难点是低能离子的能量低，理论射程很 短，活跃链霉菌未经受过低能离子处理，低能离子对活跃链霉菌作用效果受哪些因素影响， 目前并未研究清楚。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种提高活跃链霉菌突变几率的诱变方法，该 方法可以有效提高活跃链霉菌诱变几率低的问题，为后续筛选高产那西肽的突变活跃链霉 菌提供技术支持。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[0008] -种提高活跃链霉菌突变几率的诱变方法，步骤如下：
[0009] (1)取活跃链霉菌孢子至无菌水中，混合均匀，制得活跃链霉菌单孢子悬液；
[0010] ⑵将步骤（1)制得的活跃链霉菌单孢子悬液稀释至10~20cfu/mL，然后涂布 至含筛选因子的平板培养基上，进行低能离子束的梯度剂量的注射诱变，靶室真空度为 6. 0~8. 0X10 3Pa，注射脉冲剂量设定为80~100X2. 6X1013ionsAcm2 ?s)，注射完成后， 进行后续筛选培养。
[0011] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中链霉菌孢子为生长均匀、丰满的活跃链霉菌 的孢子。
[0012] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，筛选因子选自那西肽、卡那霉素。
[0013] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，筛选培养条件为：28~30°C、湿度20~60% 的条件下，培养7~8天。
[0014] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，所述筛选因子的质量百分比浓度为0. 005~ 0? 02%〇
[0015] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中，含筛选因子的平板培养基组分如下，均为质 量百分比：
[0016] 可溶性淀粉1. 5~2. 5%、蛋白胨0. 4~0. 8%、磷酸二氢钾0. 04~0. 06%、硫酸 亚铁0. 001 %、硝酸钾0. 08~0. 12 %、硫酸镁0. 04~0. 06 %、氯化钠0. 04~0. 06 %、筛选 因子0? 005~0? 02%、轻质碳酸钙0? 4~0? 6%、琼脂1. 5~2. 0%，余量水，pH6. 5~7. 0。 上述培养基可采用常规配制方法，采用纯化水配制、121°C灭菌30min。
[0017] 有益效果
[0018] 1、本发明采用低能离子束作为诱变方式，具有损伤轻、突变率高、突变普广的特 点，其与传统的物理化学诱变作用机理不同，低能离子束通过引起氨基酸和小分子无机化 合物的损伤导致电荷和基团变化等引起突变；同时发明人通过对活跃链霉菌研究，发现提 高诱变的条件，能够大大提高活跃链霉菌的突变效果。
[0019] 2、本发明所述提高活跃链霉菌突变几率的诱变方法，采用低能离子束进行诱变， 同时辅助用以那西肽和卡那霉素的抗性筛选，操作简便，效率高、筛选效果好，解除了菌种 对常规物理和化学诱变的疲劳效应。
[0020] 3、本发明通过对活跃链霉菌孢子悬液稀释后涂布含0. 01 %筛选因子的平板培养 基，再进行低能离子束脉冲注入，通过计算致死率确定最佳注入剂量，确定最佳注射剂量后 对活跃链霉菌孢子悬液进行了诱变，初筛、复筛和连续传代试验，利用本申请所述的方法， 可以极大提高活跃链霉菌的突变几率，为筛选出高性能菌株奠定了基础。
【附图说明】
[0021] 图1是实施例1的活跃链霉菌低能离子束的梯度剂量的注射诱变致死率曲线；
[0022] 图2是对比例3的活跃链霉菌紫外线诱变致死率曲线；
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但本发明所保护范围不限 于此。实施例中所使用的设备均按照现有技术。
[0024] 配制培养基：
[0025] 培养基组分如下，均为质量百分比：
[0026] 平板培养基：可溶性淀粉1. 5~2. 5%、蛋白胨0. 4~0. 8%、磷酸二氢钾0. 04~ 0. 06%、硫酸亚铁0. 001 %、硝酸钾0. 08~0. 12%、硫酸镁0. 04~0. 06%、氯化钠0. 04~ 0. 06%、轻质碳酸钙0. 4~0. 6%、琼脂1. 5~2. 0%，pH6. 5~7. 0。上述培养基可采用常 规配制方法，采用纯化水配制、121°C灭菌30min。
[0027] 斜面培养基配比：可溶性淀粉1. 5~2. 5%、蛋白胨0. 4~0. 8%、磷酸二氢钾 0. 04~0. 06%、硫酸亚铁0. 001 %、硝酸钾0. 08~0. 12%、硫酸镁0. 04~0. 06%、氯化钠 0? 04~0? 06%、轻质碳酸钙0? 4~0? 6%、琼脂1. 5~2. 0%，pH6. 5~7. 0。上述培养基可 采用常规配制方法，采用纯化水配制、121°C灭菌30min。
[0028] 种子培养基配比：蔗糖1.5~2.0%、蛋白胨0.8~1.2%、硫酸铵0. 1~0.3%、 轻质碳酸?丐〇. 3~0. 5%，纯化水配制、pH6. 5~7. 0、121°C灭菌30min。
[0029]发酵培养基配比：热榨豆饼粉3. 0~3. 5%、玉米淀粉6. 0~8. 0%、硫酸钠0. 1~ 0? 3%、磷酸二氢钾0? 01~0? 03%、硫酸铵0? 1~0? 3%、轻质碳酸钙0? 2~0? 3%、豆油 0? 5~0? 7%，自来水配制、pH自然、121°C灭菌30min。
[0030] 菌种：活跃链霉菌NX-9,购自中科院微生物所；那西肽纯品购自中国兽药监察所， 卡那霉素纯品购自中国药品生物制品鉴定所。
[0031] 实施例1:
[0032] 孢子悬液制备：
[0033] 取活跃链霉菌NX-9生产斜面一支，在超净台下向斜面内加入100mL无菌水，将斜 面孢子刮下，转入250mL灭过菌的三角瓶中，向里加入适量灭过菌的玻璃珠，放置于摇床上 震荡30min，将孢子液打碎，使用含有灭菌滤纸的漏斗过滤，得活跃链霉菌单孢子悬液；
[0034]稀释：
[0035] 将活跃链霉菌单孢子悬液依次稀释为10°、10 \ 10 2、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7,分别 取0.lmL涂布平板培养基，放置在温度28~30°C、湿度20-60%的条件下培养7~8天，计 算平板内的菌落数，平板内菌落数100~200个为宜，梯度10 3和10 4符合标准；
[0036] 诱变剂量的确定：
[0037] 将活跃链霉菌孢子悬液稀释至10 3,分别取孢子悬液0.lmL涂布在含有质 量百分比为0.01 %那西肽的平板培养基上，进行低能离子束的梯度剂量的注射诱变， 革巴室真空度为8. 0X10 3Pa，注射脉冲剂量设定为nX2. 6X1013i〇ns/ (cm2 ?s)，n= (30, 50, 70, 90, 110, 130)，选取六个梯度进行注射，注射完成后，平板放置于温度28~ 30°C、湿度20~60%的条件下培养7~8天，通过计算平板菌落数，在90X2. 6X1013i〇ns/ (cm2 ?s)的剂量下致死率达到90%，结果如图1所示。
[0038]诱变：
[0039] 将活跃链霉菌孢子悬液稀释至10 3,取孢子悬液0.lmL涂布在含有质量百分比为 0. 01 %那西肽的平板培养基上，在90X2. 6X1013i〇nV(cm2 ?S)的脉冲剂量下进行照射，照 射完成后平板放置于温度28~30°C、湿度20~60%的条件下培养7~8天，挑选单菌落 60个，接入500ml发酵瓶，同步传斜面，做好菌落编号。
[0040]初筛：
[0041] 单菌落接入发酵瓶后，在温度28~30°C、湿度20~60%的条件下培养210~ 240h，摇床转速220~240rpm，然后测定效价，效价提高幅度明显的单菌落有9个；单菌落 传斜面后在温度28~30°C、湿度20~60%的条件下培养7~8天，以效价高的9个单菌 落的斜面作为复筛的出发菌株，进行复筛。初筛结果如表1所示：<