一种多产色链霉菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是指一种多产色链霉菌菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 香蕉是世界贸易的大宗水果，在鲜果贸易中排名第一。我国是香蕉生产大国，也是 消费大国，消费量在全球排名第一。据农业部南亚办统计数据显示，2013年我国香蕉种植 面积39. 71万公顷，产量1211. 5万吨。香蕉枯萎病最早于1896年在巴拿马发生，1935~ 1939年在南美洲几个国家大面积爆发，导致90%以上的优质大蜜哈香蕉发病，约有43万 hm2遭毁，并通过出口传播到全世界。我国从20世纪70年代开始发现香蕉枯萎病，目前已 扩展到我国所有的产蕉区。近年来，我国香蕉产业的科学家不断摸索枯萎病防控的新方法、 新思路，研究表明，采用抗病品种、生物菌肥和大量施用有机肥的综合防控技术手段，可以 降低枯萎病大田发病率10% -30%。
【发明内容】
[0003] 本发明提出一种多产色链霉菌菌株及其应用，对香蕉枯萎病具有拮抗作用，抑菌 效果显著。
[0004] 本发明的第一个方面提供一种多产色链霉菌，命名为多产色链霉菌 (Streptomycespolychromogene)G59,于2015年5月25日保藏于中国典型培养物保藏中 心，地址为湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号为CCTCCNO:M2015323。
[0005] 所述多产色链霉菌G59的16SrDNA基因序列如SEQIDNO. 1所示。
[0006] 本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的多产色链霉菌G59在制备 防治香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、粉蕉枯萎病菌、香蕉大灰斑病菌、荔 枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、芒果叶枯病菌制剂中的应用。
[0007] 本发明的第三个方面是提供本发明第一个方法所述的多产色链霉菌G59在制备 抑制香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、粉蕉枯萎病菌、香蕉大灰斑病菌、 荔枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、芒果叶枯病菌菌丝生长制剂上的应 用。
[0008] 本发明的地四个方面是提供本发明第一个方法所述的多产色链霉菌G59在制备 抑制香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、粉蕉枯萎病菌、香蕉大灰斑病菌、 荔枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、芒果叶枯病菌孢子萌发制剂上的应 用。
[0009] 本发明的第五个方面是提供一种用于防控香蕉枯萎病的发酵液，所述的发酵液中 含有多产色链霉菌G59。
[0010] 进一步，所述的发酵液包含以下菌株：多产色链霉菌G59,甲基营养性芽孢杆菌 4-L-16和枯草芽孢杆菌。
[0011] 本发明的第六个方面是提供本发明第三个方面所述的一种用于防控香蕉枯萎病 的发酵液的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (1)分别培养多产色链霉菌G59、甲基营养性芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，得到3种 种子液；
[0013] (2)将上述3种种子液分别接种于发酵培养基中，发酵，即得所述的发酵液。
[0014] 进一步，所述步骤（1)中，多产色链霉菌G59种子液的制备方法为：先在平板培养 基上培养出多产色链霉菌G59菌株，然后将菌株接种于液体培养基中，培养即得多产色链 霉菌G59种子液；甲基营养性芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌种子液的制备方法为：取上述菌株， 分别置于LB液体培养基内培养，分别得到上述两种菌株的种子液；所述平板培养基组成， 以重量份数计，包括：可溶性淀粉15-20份、氯化钠0. 3-0. 5份、硝酸钾1-2份、三水合磷酸 氢二钾0. 3-0. 5份、七水合硫酸镁0. 3-0. 5份、七水合硫酸亚铁0. 01-0. 03份、琼脂15-20 份、水1000份，调节PH7. 2-7. 4,平板培养条件为温度28°C条件下培养5天；所述平板培养 基去掉琼脂粉即为液体培养基，液体培养基中培养条件为，温度28°C、180rpm震荡培养3-5 天；所述LB液体培养基组成，以重量份数计，包括：胰蛋白胨8-10份，酵母粉3-5份，氯化钠 8-10份，水1000份，培养条件为，28°C、180rpm震荡培养3天。
[0015] 进一步，所述步骤（2)中，G59菌株以10%的接种量接种于发酵培养基中，甲基营 养性芽孢杆菌4-L-16和枯草芽孢杆菌均采用5%接种量，接种于发酵培养基中；发酵培养 基配方，以重量份数计，包括：大豆粉40-50份、玉米粉8-10份、可溶性淀粉8-10份、红糖 150-200份、水1000份，发酵条件为温度为28-30°C，通气量为50 %，PH7. 0-7. 2,搅拌速度 为 150_180rpm，发酵 7 天。
[0016] 本发明所述的多产色链霉菌，经多项鉴定，确定为多产色链霉菌（Streptomyces polychromogene)G59,并于2015年5月25日在中国典型培养物保藏中心（CCTCC)进行了 菌种保藏，并证明存活，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学内，保藏编号为CCTCCNO:M 2015323〇
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 本发明所述的多产色链霉菌G59,对防治香蕉长形叶斑病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉 枯萎病菌、粉蕉枯萎病菌、香蕉大灰斑病菌、荔枝炭疽病菌、芒果炭疽病菌、芒果链格孢霉叶 斑病菌、芒果叶枯病菌均有较好的拮抗作用，对上述9种病原菌的菌丝生长和孢子萌发均 有抑制作用。以本发明所述的多产色链霉菌G59与甲基营养性芽孢杆菌4-L-16、以及枯 草芽孢杆菌混合发酵制得的发酵液，对香蕉枯萎病具有显著的防控效果，盆栽试验防效为 72. 2%，大田防效为44. 2%。
【附图说明】
[0019] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0020] 图1为基于16SrDNA序列构建的菌株G59与相关菌株的系统发育树；
[0021] 图2为菌株G59孢子及孢子丝形态；
[0022] 图3为多产色链霉菌G59对香蕉枯萎病4号生理小种的抑菌作用；
[0023] 图中，a为多产色链霉菌G59;b为香蕉枯萎病4号生理小种；
[0024] 图4为多产色链霉菌G59对为香蕉枯萎病4号生理小种孢子萌发抑制作用。
【具体实施方式】
[0025] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026] -、菌株的筛选
[0027] 分别于海南省临高县南宝镇新营农场、临高县美台镇美梅村、临高县南宝镇皇桐 村。每个地点分健康和病土（香蕉枯萎病发病区土壤）分别取样。取样方法为每个田块采 用五点随机取样混合为一个样品，采集香蕉植株根围土壤l〇cm~30cm土层。3个取样点， 共采集样品6份，从田间采集的新鲜样品放入塑料样品采集袋中，并置于冰盒中，带回实验 室置于4°C冰箱中保存备用。
[0028] 采用梯度稀释法将上述土壤样品制成10 2~104浓度梯度系列悬浮液，放线菌的 分离，采用高氏一号培养基，使用前要加入3%重铬酸钾抑制细菌、真菌的生长；细菌的分 离，采用LB培养基和10 4~10 6稀释度。用移液器分别吸取上述不同稀释度的溶液0.lmL， 滴加于培养基平板上，用L型玻棒涂布均匀，稍晾干，培养皿倒置，于25~28°C温箱中培养 2~5d，根据平板上长出的菌落的颜色、形态、大小的细菌、和放线菌的单菌落挑出到新的 培养基上进行纯化培养、菌株编号、保存并记录不同样品分离到的菌株数目。如表1所示。
[0029] 表1微生物分离与筛选结果
[0030]
[0031] 注：NB为南宝病土，NJ为南宝健康土；MB为美台病土，MJ为美台健康土；HB为皇 桐病土，HJ为皇桐健康土。
[0032] 采用平板对峙培养法，检测上述分