用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白、制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融 合蛋白、制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia Coli，ETEC)系人和幼畜 (初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪）腹泻最常见的病原性大肠杆菌，其致病力主要由黏附 素性菌毛和肠毒素两种毒力因子构成，二者密切相关且缺一不可。ETEC首先通过特异性粘 附素吸附到小肠粘膜上皮细胞表面的受体上，并定植于肠表面。初生幼畜被ETEC感染后因 剧烈水样腹泻和迅速脱水死亡，发病率、死亡率高。据统计，国内幼畜ETEC性腹泻病在幼畜 腹泻病中所占比例为：猪35 %，牛26 %，羊17 %，尤其是一周以内的新生幼畜。
[0003] 猪产肠毒素性大肠杆菌的黏附素抗原主要有F4 (K88)、F5 (K99)、F6 (987P)、 F7 (F41)和F18,其中以F4的流行最为普遍，因而也尤为重要。F4菌毛是我国仔猪腹泻病原 黏附素的优势抗原，主要引发新生仔猪、吸乳仔猪，甚至断奶仔猪发生腹泻。F5引发的仔猪 腹泻仅次于F4。
[0004] 黏附素抗原具有良好的免疫原性，用带有黏附素的菌体或纯化的黏附素抗原免疫 动物体均可以产生高效价的特异性抗体。因此，抗黏附素抗体的检测已成为诊断ETEC的重 要指标。目前，对ETEC致病因子的血清学检测方法有凝集试验、琼脂扩散试验和反向间接 血凝抑制试验等，但这些方法耗时、费力、灵敏性差、特异性不高。荧光抗体技术虽然有较好 的特异性和敏感性，但比较主观且不适合大规模样品检测；ELISA方法具有敏感性好、特异 性强、易操作等优点。以往多采用菌体作为包被抗原，虽成本低廉，但纯度和产量较低，且特 异性差，易产生交叉反应；有研究者用纯化的黏附性菌毛作为包被抗原，特异性较好，但黏 附素纯化方法较繁琐。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白，可以用 于同时检测抗F4和F5型猪产肠毒素性大肠杆菌抗体，有利于更加全面的监测猪群ETEC感 染和疫苗诱导的抗体水平。
[0006] 本发明的另一目的是提供所述融合蛋白的制备方法，该方法可以实现所述融合蛋 白可溶性表达，且该融合蛋白免疫反应性良好，产量较高。
[0007] 本发明的再一目的是提供所述融合蛋白在制备检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗 体的ELISA试剂盒方面的应用。该试剂盒检测准确、操作简便，特异性、敏感性、重复性均良 好，适合于在临床应用中进行推广，为ETEC的快速检测提供了可靠手段。
[0008] 本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0009] -种用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0010] 本发明提供所述融合蛋白的编码基因。
[0011] 优选的技术方案中，所述编码基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012] 本发明提供含有所述基因的表达盒、载体或细胞。
[0013] 本发明还提供制备所述融合蛋白的方法，包括如下步骤：将所述融合蛋白的编码 基因插入pCold I质粒，得到重组载体；将所述重组载体转化宿主细胞，获得阳性重组菌； 诱导所述阳性重组菌表达融合蛋白，纯化后得到所述融合蛋白。
[0014] 优选的技术方案中，所述编码基因的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015] 最后，本发明提供所述融合蛋白在制备检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体中的 ELISA试剂盒中的应用以及检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的ELISA试剂盒，所述试剂 盒包括采用所述融合蛋白包被的ELISA板条。
[0016] 有益效果：本发明用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白，可以用于 同时检测抗F4型以及F5型猪产肠毒素性大肠杆菌的抗体，有利于更加全面的监测猪群 ETEC感染和疫苗诱导的抗体水平。本发明所述融合蛋白的制备方法，可以实现所述融合蛋 白可溶性表达，且该融合蛋白免疫反应性良好，产量较高。本发明所述融合蛋白可以应用于 制备检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的ELISA试剂盒。该试剂盒检测准确、操作简便，特 异性、敏感性、重复性均良好，成本较低，适合于在临床应用中进行推广，为ETEC的快速检 测提供了可靠手段。
【附图说明】
[0017] 图 1 是 p Cold I-F4-F5 酶切鉴定电泳图，其中 Ml :DL-2000，M2 :DL-15000,1-3 :重 组质粒pCold I-F4-F5的EcoR I和Sail酶切产物。
[0018] 图2 :pCold I-F4-F5/BL21重组菌蛋白表达的SDS-PAGE分析，其中M :中分子量蛋 白质标准，1 :诱导后重组菌全菌蛋白；2 :诱导后重组菌裂解液上清；3 :包涵体重悬液。
[0019] 图3 :pGEX-4T-1-F4-F5/BL21重组菌SDS-PAGE分析，其中M :中分子量蛋白质标 准，1和3 :包涵体沉淀，2和4 :诱导后重组菌裂解液上清。
[0020] 图4是融合蛋白F4-F5的Western blot分析，其中M :中分子量蛋白质标准；1 :融 合蛋白F4-F5与F4阳性血清的免疫印迹；2 :融合蛋白F4-F5与F5阳性血清的免疫印迹。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0022] 实施例1制备用于检测抗ETEC抗体的融合蛋白
[0023] 1、设计用于检测抗ETEC抗体的融合基因
[0024] 通过生物学软件DNAStar分析ETEC F4 (K88)菌毛和ETEC F5 (K99)菌毛的核苷酸 和氨基酸序列。运用密码子优化软件CodonAdaptationTool (JCAT)分析后，替换F4和F5 菌毛核苷酸序列中大肠杆菌的稀有密码子为偏爱密码子，并在F4和F5菌毛的基因片段之 间添加 linker序列，设计得到了融合基因，序列如SEQ ID N0:2所示。在融合基因的5'端 添加 EcoR I酶切位点，在3'端添加 Sal I酶切位点，送南京金斯瑞生物技术公司合成。
[0025] 融合基因编码用于检测抗ETEC抗体的融合蛋白F4-F5。融合蛋白F4-F5的氨基酸 序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0026] 2、融合蛋白F4-F5表达载体的构建
[0027] 将合成的融合基因片段与pCold I载体（TaKaRa)分别使用EcoR I和Sal I双酶 切，然后混合，于37°C孵育3h。连接产物转化Trans5 α感受态细胞（TaKaRa)，并涂布至含 氨苄青霉素抗性（100 μ g/ml)的LB平板，37°C培养过夜。挑取单克隆，于含氨苄青霉素抗 性的LB培养基中振荡培养IOh后，提取质粒，酶切鉴定结果如图1所示，证实融合基因片段 成功插入载体。将该阳性重组质粒命名为pCold I-F4-F5。
[0028] 另外，将融合基因片段分别插入常用原核表达载体pET28a、pGEX-4T_l和pET22b， 经酶切鉴定后分别得到阳性重组质粒pET28a-F4-F5、pGEX-4T-1-F4-F5和pET22b-F4-F5。
[0029] 3、重组表达质粒的诱导表达
[0030] 重组质粒pCold I-F4-F5转化BL21感受态细胞（TaKaRa)，挑取阳性克隆，提取菌 体质粒酶切鉴定。将阳性重组菌命名为pCold I-F4-F5/BL21。
[0031] pCold I-F4-F5/BL21活化培养至OD6。。达到1. 2,取Iml菌液保存，其余菌液中 加入终浓度为ImM的IPTG进行诱导。诱导后每隔3h取Iml菌液，至诱导后12h。将收集 到的菌液4°C、12000r/min离心5min收集沉淀。每管沉淀用80 μ L的PBS缓冲液悬起后 加入20 μ L SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，用SDS-PAGE电泳分析。电泳结果如图 2所示，参照分子质量标准，可见诱导表达获得蛋白大小约为29kD，与融合蛋白F4-F5加 his-tag(GEhealthcare)大小一致，证明该重组质粒在大肠杆菌中得到了表达。
[0032] 取 ImL 诱导 12h 的 pCold I-F4-F5/BL21 菌液，12000rpm 离心 2min，用 300 yL PBS 缓冲液重悬菌体。冻融3次，超声破碎，离心分离上清液与沉淀。用300 μ L PBS缓冲液重 悬包涵体沉淀。各取40 μ L菌体裂解液上清与包涵体重悬液，加入10 μ L SDS-PAGE上样缓 冲液，沸水浴l〇min，进行SDS-PAGE电泳。电泳结果如图2所示，可见融合蛋白F4-F5主要 在上清中表达，表达量占菌体总蛋白的35%左右。
[0033] 另外，将重组质粒 pET28a-F4-F5、pGEX-4T-1-F4-F5 和 pET22b-F4-F5 分别按照常 规方法转入感受态细胞BL21，分析各重组菌的蛋白表达情况。以pET28a和pET22b为表达 载体时，目标蛋白没有获得表达。以PGEX-4T-1为表达载体，目标蛋白以包涵体形式表达， 分子量约为56kD，如图3所不。
[0034] 4、融合蛋白 F4-F5 的 Western Blot 实验
[0035] 取诱导后12h的p