改良的抗血清清蛋白结合变体的利记博彩app
【专利说明】改良的抗血清清蛋白结合变体
[0001] 本申请是申请日为2010年2月17日、中国申请号为201080017229. 6、发明名称为 "改良的抗血清清蛋白结合变体"的发明申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及抗血清清蛋白免疫球蛋白单一可变域D0M7h_14的改良变体，以及包 含此类变体的配体和药物偶联物、组合物、核酸、载体和宿主。
[0003] 发明背景
[0004] W004003019和W02008/096158披露了抗血清清蛋白（SA)结合模块，诸如抗SA免 疫球蛋白单一可变域（dAb)，它们具有治疗上有用的半衰期。这些文件披露了单体抗SA dAb 以及包含此类dAb的多特异性配体，例如包含抗SA dAb和特异性结合靶抗原诸如TNFRl的 dAb的配体。披露了特异性结合来自超过一种物种的血清清蛋白的结合模块，例如人/小鼠 交叉反应性抗SA dAb。
[0005] W005118642和W02006/059106披露了偶联或联合抗SA结合模块，诸如抗SA免疫 球蛋白单一可变域至药物以延长药物半衰期的概念。披露和例示了蛋白质、肽和NCE (新化 学实体）药物。W02006/059106披露了使用这种概念来延长促胰岛素剂例如肠降血糖素激 素诸如胰高血糖素样肽（GLP)-I的半衰期。
[0006] 还可参考Holt et al, "Anti-Serum albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs'，，Protein Engineering, Design&Selection, vol 21，no 5，pp283-288,2008。
[0007] W02008/096158披露了 D0M7h-14,它是一种优秀的抗SA dAb。会希望提供作为 D0M7h-14变体的且特异性结合血清清蛋白（优选来自人和非人物种的清蛋白）的改良 dAb，这会提供在疾病的动物模型中以及对于人治疗和/或诊断的效用。还会希望提供介于 相对适度和高亲和力抗SA结合模块（dAb)之间的选择。此类模块可连接至药物，抗SA结 合模块根据设想的目的应用来选择。这会容许更好地剪裁药物来治疗和/或预防慢性或急 性适应证，取决于抗SA结合模块的选择。还会希望提供在溶液中是单体或基本上这样的抗 dAb。这在抗SA dAb连接至结合模块例如特异性结合细胞表面受体诸如TNFRl的dAb (其目 的是拮抗该受体）时会是尤其有利的。抗SA dAb的单体状态在减少受体交联的机会方面是 有用的，因为不太可能形成多聚体，多聚体能结合并交联细胞表面上的受体（例如TNFR1)， 如此增加受体激动和有害受体信号传导的可能性。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明的各方面解决了这些问题。
[0010] 为此目的，本发明人令人惊讶地发现有益突变可靶向相对于D0M7h-14而言的 ⑶R3区92至96 (位置编号方式依照Kabat)。
[0011] 因此，在一个方面，本发明提供D0M7h_14的抗血清清蛋白（SA)免疫球蛋白单一可 变域变体，其中所述变体与D0M7h-14相比包含⑶R3区92至96 (位置编号方式依照Kabat) 中的至少一处突变，且其中所述变体与D0M7h-14的氨基酸序列相比具有1至8处变化。还 提供抗血清清蛋白（SA)结合模块，其包含本发明这个方面的变体的CDR3。
[0012] 本发明的另一个方面提供D0M7h_14的抗血清清蛋白（SA)免疫球蛋白单一可变域 变体，其中所述变体与D0M7h-14相比包含位置22处的Ser和位置42处的Glu (编号方式 依照Kabat)，且其中所述变体与D0M7h-14的氨基酸序列相比具有O至4处别的变化。
[0013] 本发明任何方面的各实施方案提供具有优秀抗血清清蛋白亲和力的D0M7h_14变 体。变体的选择能容许根据期望的治疗和/或预防背景来剪裁半衰期。例如，在一个实施方 案中，变体对血清清蛋白的亲和力相对较高，使得变体对于包括在用于治疗和/或预防慢 性或持久疾病、状况、毒性或其它慢性适应证的产物中会是有用的。在一个实施方案中，变 体对血清清蛋白的亲和力相对适度，使得变体对于包括在用于治疗和/或预防急性疾病、 状况、毒性或其它急性适应证的产物中会是有用的。在一个实施方案中，变体对血清清蛋白 的亲和力是中等的，使得变体对于包括在用于治疗和/或预防急性或慢性疾病、状况、毒性 或其它急性或慢性适应证的产物中会是有用的。
[0014] 能想到对血清清蛋白具有适宜高亲和力和特异性的分子会在循环中停留足够久 来具有期望治疗效果（Tomlinson, Nature Biotechnology 22,521-522(2004))。在此，高 亲和力抗SA变体在血清循环中的停留会匹配物种的血清清蛋白（W02008096158)。一旦在 循环中，任何融合至AlbudAb?变体（AlbudAb是抗血清清蛋白dAb或免疫球蛋白单一可变 域）的治疗剂（它是NCE、肽或蛋白质）因此会能够对其靶物作用更久并展现更持久的治疗 效果。这会容许靶向慢性或持久病，无需频繁服药。
[0015] 具有适度亲和力（但是对SA的特异性）的变体只会在血清循环中停留较短时间 (例如几小时或几天），容许融合的治疗剂特异性靶向急性病中涉及的治疗靶。
[0016] 这样有可能通过选择具有适宜清蛋白结合亲和力和/或血清半衰期的抗SA变体 来剪裁含有抗SA的产物适应治疗疾病领域。
[0017] 本发明的一个方面提供多特异性配体，其包含任何上文所述抗SA变体和特异性 结合SA以外的靶抗原的结合模块。
[0018] 本发明的一个方面提供融合产物，例如与肽或NCE (新化学实体）药物的融合蛋白 或融合物，其包含融合或偶联（对于NCE)至任何上文所述变体的多肽、蛋白质、肽或NCE药 物，其中所述变体是D0M7h-14-10 (或具有与D0M7h-14-10的氨基酸序列至少95、96、97、98 或99%相同的氨基酸序列的变体）。D0M7h-14-10在融合或偶联至配偶时只给出亲和力的 适度下降，使得它在融合产物中有用。
[0019] 本发明的一个方面提供组合物，其包含任何前述方面的变体、融合蛋白或配体和 药学可接受稀释剂、载体、赋形剂或媒介。
[0020] 本发明的一个方面提供在患者中治疗或预防疾病或病症的方法，包括将至少一剂 依照本发明任何方面或实施方案的变体施用于所述患者。
[0021] 本发明的一个方面提供多肽融合物或偶联物，其包含本文所公开抗血清清蛋 白dAb (例如D0M7h-14-10)和肠降血糖素或促胰岛素剂，例如毒蜥肽-4、GLP-I (7-37)、 GLP-I (6-36)或W006/059106中披露的任何肠降血糖素或促胰岛素剂，这些药剂通过述及 而明确收入本文就像在本文中写明包括在本发明和所附权利要求中。
[0022] 具体地，本发明涉及以下方面：
[0023] I. D0M7h-14的抗血清清蛋白（SA)免疫球蛋白单一可变域变体（D0M7h-14如图1 所示），其中所述变体与D0M7h-14相比包含⑶R3区92至96 (位置编号方式依照Kabat)中 的至少一处突变，且其中所述变体与D0M7h-14的氨基酸序列相比具有1至8处变化。
[0024] 2.项1的变体，其中所述变体包含AQG(Xl) (X2) (X3)P(X4)T基序，其中A在位置 89(依照Kabat)，且（Xl)至（X4)中至少一个代表与D0M7h-14的序列相比的氨基酸变化。
[0025] 3.项1或2的变体，其中所述变体与D0M7h-14相比包含位置92、93和94中每一 处和任选位置96 (编号方式依照Kabat)处的突变。
[0026] 4.项3的变体，其中所述变体包含一或多个选自下述的氨基酸残基
[0027] 位置 92 = L 或 F，
[0028] 位置 93 = R、M 或 K，
[0029] 位置94 = H或K，和
[0030] 位置96 = K或M (编号方式依照Kabat)。
[0031] 5.项1或2的变体，所述变体与D0M7h_14相比包含位置96处的Lys或Met (编号 方式依照Kabat)。
[0032] 6.项5的变体，其中所述变体包含一或多个选自下述的氨基酸残基
[0033] 位置 92 = L 或 F，
[0034] 位置 93 = R、M 或 K，和
[0035] 位置94 = H或K (编号方式依照Kabat)。
[0036] 7.项1的变体，其中所述变体包含与选自D0M7h-14-10 (SEQ ID NO: 1)、 D0M7h-14-18(SEQ ID N0:2)、D0M7h-14-28(SEQ ID N0:4)和D0M7h-14-36(SEQ ID N0:5)的 单一可变域的氨基酸序列相同或与所选氨基酸序列相比具有多至4处变化的氨基酸序列， 其中所述变体与D0M7h-14相比包含⑶R3区92至96 (位置编号方式依照Kabat)中的至少 一处突变。
[0037] 8.抗血清清蛋白（SA)结合模块，其包含任何前述项的所选变体的⑶R3。
[0038] 9.项8的结合模块，其包含所选变体的⑶Rl或与所选变体的⑶Rl至少50 %相同 的氨基酸序列。
[0039] 10.项8或9的结合模块，其包含所选变体的⑶R2或与所选变体的⑶R2至少50 % 相同的氨基酸序列。
[0040] 11. D0M7h-14的抗血清清蛋白（SA)免疫球蛋白单一可变域变体，其中所述变体与 D0M7h-14相比包含位置22处的Ser和位置42处的Glu (编号方式依照Kabat)，且其中所 述变体与D0M7h-14的氨基酸序列相比具有0至4处别的变化。
[0041] 12.项11的变体，其中所述变体包含与D0M7h-14-19(SEQ ID N0:3)的氨基酸序列 相同或与D0M7h-14-19的氨基酸序列相比具有多至4处变化的氨基酸序列，其中所述变体 与D0M7h-14相比包含位置22处的Ser和位置42处的Glu (编号方式依照Kabat)。
[0042] 13.前述项任一项的变体或结合模块，其中所述变体或结合模块包含以约0. 1至 约ΙΟΟΟΟηΜ、任选约1至约6000nM的解离常数（Kd)特异性结合人SA的结合位点，如通过表 面等离振子共振测定的。
[0043] 14.前述项任一项的变体或结合模块，其中所述变体或结合模块包含以约I. 5x 10 4至约0.1 sec \任选约3x 10 4至约0.1 sec 1的解离速率常数（K d)特异性结合人SA的 结合位点，如通过表面等离振子共振测定的。
[0044] 15.前述项任一项的变体或结合模块，其中所述变体或结合模块包含以约2xl06至 约lx IO4M 1Sec \任选约lx IO6至约2x IO4M 1Sec 1的结合速率常数（Ka)特异性结合人SA 的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的。
[0045] 16.前述项任一项的变体或结合模块，其中所述变体或结合模块包含以约0. 1至 约ΙΟΟΟΟηΜ、任选约1至约6000nM的解离常数（Kd)特异性结合猕猴SA的结合位点，如通过 表面等离振子共振测定的。
[0046] 17.前述项任一项的变体或结合模块，其中所述变体或结合模块包含以约1.5x 10 4至约0.1 sec \任选约3x 10 4至约0.1 sec 1的解离速率常数（K d)特异性结合猕猴SA 的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的。
[0047] 18.前述项任一项的变体或结合模块，其中所述变体或结合模块包含以约2xl06至 约lx IO4M 1Sec \任选约lx IO6至约5x 10 3M 1Sec 1的结合速率常数（K J特异性结合猕猴 SA的结合位点，如通过表面等离振子共振测定的。
[0048] 19. 一种多特异性配体，其包含前述项任一项的抗SA变体或结合模块和特异性结 合除SA以外的靶抗原的结合模块。
[0049] 20.项1至18任一项的抗SA变体单一可变域或模块，其中所述可变域或模块偶联 至药物（任选NCE药物），任选其中所述可变域或模块是D0M7h-14-10(SEQ ID N0:1)。
[0050] 21. -种融合蛋白，包含与依照项1至18任一项的变体或模块融合的多肽或肽药 物，任选其中所述变体或模块是D0M7h-14-10(SEQ ID N0:1)。
[0051] 22. -种组合物，其包含前述项任一项的变体、模块、融合蛋白或配体和药学可接 受稀释剂、载体、赋形剂或媒介。
[0052] 23. -种核酸，其包含编码项1至18任一项的变体或模块或项20的多特异性配体 或项21的融合蛋白的核苷酸序列。
[0053] 24. -种核酸，其包含D0M7h_14变体的核苷酸序列，所述序列选自核苷酸序列 D0M7h-14-10(SEQ ID N0:l)、D0M7h-14-18(SEQ ID N0:2)、D0M7h-14-28(SEQ ID N0:4)、 D0M7h-14-36(SEQ ID N0:5)或 D0M7h-14-19(SEQ ID N0:3)或与所述选定序列至少 80%相 同的核苷酸序列。
[0054] 25. -种载体，其包含项23或24的核酸。
[0055] 26. -种分离的宿主细胞，其包含项25的载体。
[0056] 27. -种在患者中治疗或预防疾病或病症的方法，包括将至少一剂项1至18任一 项的变体或模块施用于所述患者。
[0057] 附图简述
[0058] 图I :D0M7h-14变体dAb的氨基酸序列比对。特定位置处的"指示与在D0M7h-14 中在该位置处找到的氨基酸相同的氨基酸。CDR以下划线和粗体文本指示（第一段标有 下划线的序列是CDR1，第二段标有下划线的序列是CDR2,而第三段标有下划线的序列是 CDR3)〇
[0059] 图2 :D0M7h_14变体的动力学参数。Kd单位=nM ;K d单位=sec a单位= M1Sec1c3记数法Ae-B表示A x 10 8而CeD表示C x IOd。指示了多种物种中的总体动力学 范围，如得到下文例子支持的。还提供了供特定治疗背景（急性或慢性适应证、状况或疾病 和供慢性和急性背景二者使用的"中等"）使用的任选范围。高亲和力dAb和包