姚虻天然抗炎症多肽cecropin-TY1及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提取自姚蛇唾液腺的天然抗炎症多肽cecropin-??Ι及其在抗炎症中的新应用，属于生物医学技术领域。
【背景技术】
[0002]近年来，随着传统抗生素的滥用，微生物对传统抗生素产生了越来越强的耐受性，微生物感染已成为严重威胁人类健康的难题。这些微生物中特别是革兰氏阴性细菌感染时能释放脂多糖(LPS)，会引发脓毒血症和内毒素休克。一直以来对微生物感染引发的脓毒血症的主要治疗方法为输液、改善机体供氧、抗感染治疗和免疫治疗等。同时这些治疗方法又存在着诸多不足，比如抗感染治疗会导致大量细菌被杀死而释放出大量内毒素，加剧脓毒血症。因此，这就需要持续开发新的治疗脓毒血症的制剂。
【发明内容】
[0003]为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种姚虻天然抗炎症多肽cecropin-TYl 及其应用。
[0004]本发明的技术方案是:
[0005]Cecropin抗菌肽是一类具有抗菌功能的一种小分子多肽，其中一部分cecropin抗菌肽还具有抗炎的功能，而且能中和内毒素，即在抗菌的同时能中和细菌感染是所释放的内毒素，并发挥抗炎功能。根据报道，有研究者基于宿主-体外寄生虫相互作用的关系，对吸血昆虫姚蛇(Tabanus yao)成功吸血机制进行研究，从姚蛇唾液腺中发现了 cecropin类多肽 cecropin-TYl。
[0006]本发明所述的姚虻天然抗炎症多肽cecropin-TYl，提取自姚虻唾液腺，由39个氨基酸组成，碳末端酰胺化，分子量为3970.22道尔顿，等电点为11.17，其氨基酸序列为SEQID: 1，即 GlylTry2Leu3Lys4Lys5Ile6Gly7Lys8Lys9Ilei0GlullArgi2Vali3Glyi4Gln15Asn16Val17Arg18Asni9Ala2oAla2iIle22Ser23Thr24Ile25Pro26Ile27Ala28Gln29Gly3oAla3iAla32Gly33Val34Ala35Gly36Ala37Leu3SAsn39-NH2，且其中所有氨基酸均为L-型。
[0007]本发明所述的姚蛇天然抗炎症多肽cecropin-??Ι在制备抗炎药物、细菌感染引起的脓毒血症和内毒素休克药物、兽药、动物饲料及化妆品中的应用。
[0008]其具体的为:
[0009]本发明所述的姚蛇天然抗炎症多肽cecropin-TYl在抑制脂多糖诱导的巨■细胞产生一氧化氮中应用；在抑制脂多糖诱导的巨噬细胞产生炎症细胞因子中的应用；在抑制脂多糖诱导的炎症信号通路中的应用，包括在抑制脂多糖诱导的丝裂原活化蛋白激酶信号通路的激活中的应用，和在抑制脂多糖诱导的核转录因子NF-κΒ的激活中的应用；在中和内毒素功能中的应用。
[0010]借由上述方案，本发明至少具有以下优点:本发明中所述提取自姚虻唾液腺中的天然抗炎症多肽cecropin-TYl具有分子量小、合成简单、抗炎效果明显、细胞毒性低的特点，在医药、化妆品和养殖业等领域具有广泛的应用前景。
[0011]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
【附图说明】
[0012]图1是本发明Cecropin-TYl抑制诱导型一氧化氮合酶的转录结果图；
[0013]图2是本发明Cecropin-TYl抑制亚硝酸盐的产生的结果图；
[0014]图3是本发明Cecropin-TYl抑制炎症细胞因子的产生的结果图；
[0015]图4是本发明Cecropin-TYl抑制MAPKs的激活的结果图；
[0016]图5是本发明cecropin-TYl抑制NF- κ B的激活的结果图；
[0017]图6是本发明cecropin-TYl对小鼠巨噬细胞的毒性；
[0018]图7是本发明cecropin-TYl的内毒素中和活性；
[0019]图8是本发明cecropin-TYl在不同溶液中的圆二色谱图；
[0020]图9是本发明cecropin-??Ι的溶液结构模拟示意图。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图和具体实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0022]—、姚虻唾液免抗炎症多肽cecropin-TYl对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞一氧化氮(NO)产生的影响。
[0023](I)、抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的转录:
[0024]诱导型一氧化氮合酶(iNOS)是一氧化氮(NO)产生所必须的合成酶，首先检测cecropin-TYl对一氧化氮合酶转录水平的影响。C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞铺于24孔细胞培养板中(2.5 X 15细胞/孔)，用加有2%胎牛血清、100U/mL氨苄青霉素和100 μ g/mL硫酸链霉素的RMP1-1640培养基(购买自美国Gbico公司)培养，待细胞贴壁后，如图1标注所示，在细胞中加入100ng/mL脂多糖(LPS，来自于大肠杆菌Escherichia coli 0111:B4,购买自Sigma)，同时分别加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-??Ι，并分别设置多种对照组，包括:只加LPS组、只加多肽组(10 μ g/mL)和既不加LPS又不加cecropin-TYl组。共孵育6小时后，收集细胞，用Trizol (购买自Takara)裂解细胞，提取RNA，用逆转录试剂盒(购买自Takara)合成cDNA，并用荧光定量PCR检测不同处理的细胞中iNOS的转录水平。
[0025]由图1可见，cecropin-TY以剂量依赖的方式抑制了 iNOS的转录。只加LPS处理的细胞的iNOS的转录水平设定为100%，而加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-TYl处理后，iNOS 的转录水平分别只有 41.2%、31.3%和 15.8%, cecropin-TYl 减少了 58.8%、68.7%和84.2%的iNOS的转录。
[0026](2)、抑制亚硝酸盐的产生:
[0027]细胞培养基中亚硝酸盐(nitrite)的累积水平可以间接反映NO的产生，接着检测了 cecropin-TYl对亚硝酸盐产生的影响。将C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞铺于24孔细胞培养板中(2.5 X 15细胞/孔)，用加有2%胎牛血清、100U/mL氨苄青霉素和100 μ g/mL硫酸链霉素的RMP1-1640培养基(购买自美国Gbico公司)培养，待细胞贴壁后，如图2标注所示，在细胞中加入lOOng/mL脂多糖(LPS，来自于大肠杆菌Escherichia coli 0111:B4，贝勾买自Sigma)，同时分别加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-TYl，并分别设置多种对照组，包括:只加LPS组、只加多肽组(10 μ g/mL)和既不加LPS又不加cecropin-TYl组。共孵育24小时后，收集培养上清，用格里斯试剂(购买自碧云天)检测不同处理的细胞后细胞培养上清亚硝酸盐的累积水平。
[0028]由图2可见，cecropin-TY以剂量依赖的方式抑制了亚硝酸盐的产生。只加LPS处理组亚硝酸盐的累积水平为20.4 μ M，加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-TYl处理后，亚硝酸盐的累积水平分别只有12.0,7.3和5.0 μ M，cecropin-TYl减少了 40.0,63.7和75.0%的亚硝酸盐的产生。
[0029]二、姚虻唾液抗炎症肽cecropin-TYl对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎症细胞因子产生的影响。
[0030]将C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞铺于24孔细胞培养板中(2.5X 15细胞/孔)，用加有2%胎牛血清、100U/mL氨苄青霉素和100 μ g/mL硫酸链霉素的RMP1-1640培养基(购买自美国Gbico公司)培养，待细胞贴壁后，如图3标注所示，在细胞中加入10ng/mL脂多糖(LPS，来自于大肠杆菌Escherichia col1lll:B4，购买自Sigma)，同时分别加入5、10和20 μ g/mL的cecropin-TYl，并分别设置多种对照组，包括:只加LPS组、只加多肽组(10 μ g/mL)和既不加LPS又不加cecropin-TYl组。共孵育6小时后，收集细胞培养上清，用酶联免疫试剂盒(购买自达科为)检测细胞因子肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素-1β (IL-Ιβ)和白介素-6(IL-6)的累积水平。同时收集细胞，用Trizol(购买自Takara)裂解细胞，提取RNA，用逆转录试剂盒(购买自Takara)合成cDNA，并用荧光定量PCR检测不同处理的细胞中炎症细胞因子TNF-a、IL-1 β和IL_6的转录水平。
[0031]如图3所示，cecropin-TYl以剂量依赖的方式抑制了 LPS诱导的炎症细胞因子TNF-α ,IL-1 β和IL-6的转录和产生。在浓度为20mg/mL时，cecropin-TYl抑制了 60.3%的 TNF-a、67.5% 的 IL-1 β 和 94.1 % 的 IL-6 的转录，同时，20mg/mL 的 cecropin-TYl 减少了 72.1%的 TNF-a、63.4%的 IL-1 β 和 76.2%的 IL-6 的产生。
[0032]三、Cecropin-TYl对炎症信号通路的影响。
[0033]将C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞铺于6孔细胞培养板中(I X 16细胞/孔)，用加有2%胎牛血清、100U/mL氨苄青霉素和100 μ g/mL硫酸链霉素的RMP1-1640培养基(购买自美国Gbico公司)培养，待细胞贴壁后，如图4和图5标注所示，在细胞中加入lOOng/mL脂多糖(LPS，来自于大肠杆菌Escherichia c