一种用于检测xy染色体异常的fish探针、试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测XY染色体异常的FISH探针、试 剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 焚光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH)是在 20 世纪 80 年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以 荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法.FISH的基本原理是将DNA(或 RNA)探针用特殊的核苷酸分子或者荧光素分子偶联标记，然后将探针直接杂交到染色体 或DNA纤维切片上，通过与靶序列的特异性结合来进行DNA的定性、定位、相对定量分析， FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点。
[0003] 自1971年巴黎国际染色体命名会议以来，已发现人类染色体数目异常和结构畸 变3000余种，目前已确认染色体病综合征100余种，智力低下和生长发育迟滞是染色体病 的共同特征。
[0004] 最常见的染色体疾病Down综合征（Down' ssyndrome)的新生儿发病率为1/700~ 1/600。除Down综合征之外，13三体综合征（trisomyl3syndrome)的活婴发病率为1/2000， 女性多于男性，患儿母亲平均生育年龄为31岁。18三体综合征（trisomyl8syndrome)的 活婴发病率为1/4000女性多见患者母亲平均生育年龄为34岁。脆性X染色体综合征 (fragile-Xsyndrome)估计可使1/1500的男婴受累由于女性具有两条X染色体，受累率为 50%，程度较轻Klinefelter综合征（Klinefelter' ssyndrome)的染色体表型为XXY，仅见 于男性。Turner综合症的染色体为X0(45X)型，仅见于女性。Williams综合征的新生儿 发病率为1/2万，Prader-Willi综合征的新生儿发病率为1/2万，Rett综合征的发病率为 1/1. 5万~1/1万，仅见于女性。
[0005] 骨髓移植是各种血液肿瘤及某些先天性免疫缺乏症的根治方法。是将正常骨髓由 静脉输入患者体内，取代病变骨髓，重建患者的造血功能和免疫功能。异性骨髓移植中，会 出现血液细胞性染色体的变化，因此，XY染色体检测能够用于性染色体错配的骨髓移植的 效果监测。
[0006] 常规FISH杂交时间在10~24小时，需过夜进行检测。基于BAC的杂交探针包含 除重复片段外的长片段序列，序列的复杂性导致杂交时间长，杂交背景高，易受外界条件影 响。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测XY染色体异常 的FISH探针，用于染色体异常的检测。
[0008] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0009]一种用于检测XY染色体异常的FISH探针，该FISH探针以人类全基因组为模板， 利用X引物对和Y引物对进行PCR扩增反应而得，所述X引物对和Y引物对的序列如下：
[0010] X引物对序列为，
[0011] F : 5 ' -AAACAGTGTTTCCAAACTGCTGA-3'，
[0012] R :5'-TTGTAGAATCTGCGAAGGGACAT-3'；或
[0013] F : 5 ' -TTCTTTCTAGTTTTTATCTGGGGAT-3'，
[0014] R :5' -CTATCTGAGAAACTGCTTTGTGATG-3;或
[0015] F :5，-AAGGAAAAGGCTTGTAATTTCCCAT-3，，
[0016] R :5'-AATCAAAAGGAGGGTTCAACTGTGT-3'；
[0017] Y引物对序列为：
[0018] F :5' -TCTGAGACACTTCTTTGTGGTAT-3，，
[0019] R :5'-CTCAAAATATCCACTTTCACATT-3'；或
[0020] F : 5 ' -GAGACACTTCTTTGTGGTATGTGC-3'，
[0021] R :5'-ACAATGGGCCTCAAAGTGCT-3'；或
[0022] F :5, -ACTTTGAGGCCCATTGTGGA-3,；
[0023]R : 5，-CGCTCAAAATATCCACTTTCACAT-3，。
[0024]作为优选的方案，用于检测XY染色体异常的FISH探针中，所述X引物对为
[0025] F : 5，-AAGGAAAAGGCTTGTAATTTCCCAT-3，，
[0026]R :5,-AATCAAAAGGAGGGTTCAACTGTGT-3,；
[0027] Y引物对为：
[0028] F : 5 ' -TCTGAGACACTTCTTTGTGGTAT-3，，
[0029]R: 5，-CTCAAAATATCCACTTTCACATT-3，。
[0030]一种用于检测XY染色体异常的FISH探针的制备方法，该制备方法的步骤如下：
[0031] 1)片段筛选：通过NCBI数据库检索Xpll. 1-qll. 1和Ypll. 1-qll. 1区段，标记出 satellite DNA；
[0032] 2)引物设计：将上述标记出satellite DNA重复序列导入引物设计软件进行引物 设计，并人工合成X引物对和Y引物对，序列为SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0. 12 ;
[0033] 3) PCR扩增：以人类基因组DNA为模板，X引物对和Y引物对，分别在PCR体系中进 行体外扩增，通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，确认PCR的特异性的扩增 产物；
[0034] 4)克隆质粒的制备：将上述扩增产物纯化后得到目的产物，将纯化后的目的产物 与载体PMD18-T连接，制备出包含目的片段的克隆质粒pMD18-T-X，pMD18-T-Y ;
[0035] 5)制备探针：以上述包含目的片段的克隆质粒为模板，制备荧光素标记的FISH探 针。
[0036] 具体地，步骤3)所述PCR体系为：
[0037]
[0038] 总体积为50 y L ;
[0039] PCR反应条件为：
[0040] 95 °C 3 分钟；
[0041] 94°C 30 秒，58 °C 30 秒，72 °C 45 秒，40 个循环；
[0042] 72 °C 10 分钟。
[0043] 进一步的，步骤5)探针的制备方法如下：以包含目的片段的质粒为模板，使用荧 光素标记的dUTP直接进行PCR扩增，将PCR产物标记荧光，避光、-20 °C储存。
[0044] 步骤5)所述的PCR扩增中PCR反应体系：
[0045]
[0046] 进一步的，步骤5)探针的制备方法如下：以包含目的片段的质粒为模板，使用荧 光素标记的dUTP利用切口平移方法进行反应，将质粒标记荧光，避光、_20°C储存。
[0047] 本发明的另一目的在于将上述FISH探针用于制备检测XY染色体异常的试剂或试 剂盒中。
[0048] 本发明还提供了一种用于检测XY染色体异常的试剂盒，该试剂盒包含本发明所 述的FISH探针。
[0049] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0050] 1.相对于传统的BAC FISH，本发明所述的FISH探针包含特异的高度重复序列片 段，反应体系中不需使用封闭DNA，背景更低；探针中所包含的短片段在进行杂交时较长片 段（如基于BAC细菌人工染色体）所需的时间更短；
[0051] 2.本发明所述的FISH探针可以很好检测出XY染色体异常，具有快速的特点，可够 应用于快速检测中；
[0052] 3.本发明所述的试剂盒具有反应灵敏、快速等特点。
[0053] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0054] 图1为PCR产物的电泳图；
[0055] 图2中期或间期染色体DNA，荧光原位杂交后的荧光信号图；
[0056] 图3羊水样本检测结果图（阴性）；
[0057] 图4羊水样本检测结果图（阳性）；
[0058] 图5骨髓移植中的应用结果图。
【具体实施方式】
[0059] -种用于检测XY染色体异常的FISH探针，一种用于检测XY染色体异常的FISH 探针，该FISH探针以人类全基因组为模板，利用X引物对和Y引物对进行PCR扩增反应 而得，所述乂引物对的序列为观〇10勵.1-5￡〇10勵.6，所述￥引物对的序列为5￡〇10 NO. 7-SEQ ID NO. 12〇
[0060] 本发明的另一目的在于提供一种用于检测XY染色体异常的FISH探针的制备方 法，该制备方法的步骤如下：
[0061] 1)片段筛选：通过NCBI数据库检索Xpll. 1-qll. 1和Ypll. 1-qll. 1区段，标记出 satellite DNA ；
[0062] 2)引物设计：将上述标记出satellite DNA重复序列导入引物设计软件进行引物 设计，并人工合成X引物对和Y引物对，序列为SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0. 12 ;
[0063] 3) PCR扩增：以人类基因组DNA为模板，X引物对和Y引物对，分别在PCR体系中进 行体外扩增，通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，确认PCR的特异性的扩增 产物；
[0064] 4)克隆质粒的制备：将上述扩增产物纯化后得到目的产物，将纯化后的目的产物 与载体PMD18-T连接，制备出包含目的片段的克隆质粒pMD18-T-X，pMD18-T-Y ;
[0065] 5)制备探针：以上述包含目的片段的克隆质粒为模板，制备荧光素标记的FISH探 针。
[0066] 具体的，步骤5)探针的制备方法如下：以包含目的片段的质粒为模板，使用荧光 素标记的dUTP直接进行PCR扩增，将PCR产物标记荧光，避光、-20 °C储存。
[0067] 具体地，步骤5)探针的制备方法如下：以包含目的片段的质粒为模板，使用荧光 素标记的dUTP利用切口平移方法进行反应，将质粒标记荧光，避光、-20°C储存。
[0068] 本发明的另一目的在于将上述FISH探针用于制备检测XY染色体异常的试剂或试 剂盒中。
[0069] 本发明还提供了一种用于检测XY染色体异常的试剂盒，该试剂盒包含本发明所 述的FISH探针。
[0070] 以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中除了FISH探针以外，其余的试剂均 可以通过市售途径获取。
[0071] 实施例1
[0072] 1)片段筛选：NCBI数据库检索Xpll. 1-qll. 1和Ypll. 1-qll. 1区段，标记出 satellite DNA；
[0073] 2)引物设计：将上述标记出satellite DNA重复序列导入引物设计软件进行引物 设计，并人工合成X引物对和Y引物对，
[0074] 从以下所述X引物对序列中选择一组上、下游序列：
[0075] F：5, -AAACAGTGTTTCCAAACTGCTGA-3, (SEQ ID NO. 1),
[0076] R :5' -TTGTAGAATCTGCGAAGGGACAT-3'（SEQ ID NO. 2);或
[0077] F :5' -TTCTTTCTAGTTTTTATCTGGGGAT-3'（SEQ ID NO. 3)，
[0078] R :5' -CTATCTGAGAAACTGCTTTGTGATG-3(SEQ ID NO. 4);或
[0079] F :5' -AAGGAAAAGGCTTGTAATTTCCCAT-3，（SEQ ID NO. 5)，
[0080] R：5, -AATCAAAAGGAGGGTTCAACTGTGT-3, (SEQ ID NO. 6)；
[0081] 从以下Y引物对序列中选择一组上、下游序列：
[0082] F :5' -TCTGAGACACTTCTTTGTGGTAT-3'（SEQ ID N0. 7)，
[0083] R :5' -CTCAAAATATCCACTTTCACATT-3'（SEQ ID NO. 8);或
[0084] F :5'-GAGACACTTCTTTGTGGTATGTGC-3'（SEQ ID NO. 9)，
[0085] R :5' -ACAATGGGCCTCAAAGTGCT-3'（SEQ ID NO. 10);或
[0086] F :5' -ACTTTGAGGCCCATTGTGGA-3'（SEQ ID NO. 11);
[0087] R :5' -CGCTCAAAATATCCACTTTCACAT