用于高效基因传递的葡聚糖肽混合物的利记博彩app
【专利说明】用于高效基因传递的葡聚糖肽混合物 相关申请的交叉引用
[0001] 本申请要求2014年2月14日提交的美国临时专利申请序列号为61/939,951，标 题为"用于高效基因传递的葡聚糖肽混合物"的优先权，将该专利申请的全部内容并入本申 请中作为参考。
技术领域
[0002] 本发明的一种或多种实施方式涉及一种用于基因传递的新的组合物。在某些实施 方式中，本发明涉及具有一个或多个含有阳离子肽侧链的多糖聚合物，该侧链可复合并传 递核酸至细胞。 政府的支持
[0003] 本发明至少部分是由美国国家科学基金会（NSF)的授权号DMR-1206923的支持而 研发的。美国政府可拥有本发明的某些权利。 序列表
[0004]序列表文件 UOA. llll.US Sequence Listing_ST25. txt，具有 1，759 字节大小，制 作日期为2015年1月21日，其随本申请一起通过电子提交，全部内容并入本申请中作为参 考。
【背景技术】
[0005] 在过去的二十年中，由于基因疗法是一种用于治疗目前认为是不治之症的基因疾 病或者获得性疾病的有前途的策略，因此，基因疗法已经显著引起了人们的兴趣。基因治 疗的成功依赖于安全和高效的基因传递系统。这些系统必须具有以下特征，DNA保护，细胞 摄取，内体脱离作用（endosomal escape)和低毒性，以克服基因治疗中的障碍。迄今为止， 已经开发了各种传递系统，它们可分为两类：病毒和非病毒载体，非病毒载体的效率不如 病毒载体，但是由于非病毒载体可以避免与病毒相关的问题，包括生产的复杂性、免疫原性 (immunogenicity)和诱变（mutagenesis)，其提供了较安全的传递策略。目前，大部分的非 病毒载体由合成材料制得，如阳离子脂质，聚合物和树枝状聚合物（dendrimer)。它们中的 一些可以在体外高效诱导转染；然而，这些系统中的许多在体内具有较高的毒性，较低的生 物降解性和较差的生物相容性。
[0006] 已研究得出天然材料（如阳离子多糖和肽）可作为潜在的基因传递携带者以避免 基于合成材料的携带者相关的慢性毒性。由于脱乙酰壳多糖（Chitosan)的生物相容性，已 广泛研究其可作为基因传递携带者，但是，但它的转染效率仍不能令人满意并且在中性条 件下的溶解度较低。天然氨基酸组成的肽载体与生物环境相容，较低的细胞毒性和生物可 降解性。由于不同的属性氨基酸块可提供给我们开发具体所需的功能的多功能药物携带者 的自由，因此，这些载体对合理的设计是适用的。例如，在生理环境中带正电荷的精氨酸残 基已被用于凝结带负电荷的治疗性DNA或RNA。将组氨酸残基引入到肽中以帮助DNA的脱 离内体，从而提高转染效率。先前的研究表明，具有肽配体序列的集成肽能够实现靶向基因 传递至特定细胞。然而，该肽的尺寸必须超过一定的值以容纳所有需要的功能，这将极大地 增加肽的成本。
[0007] 一般地，天然聚合物基的基因携带者的进一步发展存在三个主要障碍，首先，所有 报告基因药物载体仅仅提供了所需的部分功能，如高转染效率，长期的血液循环和有效的 靶向特性；其次，一般地，天然聚合物的基因转染效率一直很低；第三，这些天然聚合物基 的携带者的载药效率也一直很低，因此最佳的基因转染是在相对较高的N/P比下实现的。 所需要的技术是使用可生物降解的，有效率的和集成的天然聚合物并具有高转染效率，长 期的血液循环和有效的靶向特性的基因传递系统。
【发明内容】
[0008] 本发明的一种或多种实施方式提供了一种用于基因传递的新的组合物，涉及一组 具有一个或多个含有阳离子肽的核酸传递侧链的多糖聚合物。在某些实施方式中，这些阳 离子肽凝结并物理键合到一种或多种核酸上以形成允许核酸传递并转染进细胞内的多糖 核酸复合体（polysaccharide-nucleic acid complex)。在某些实施方式中，本发明的多糖 聚合物也可具有一个或多个两性离子侧链和/或反应性侧链。
[0009] 第一方面，本发明涉及用于核酸传递的多糖聚合物组合物，其含有：多糖聚合物链 和一个或多个键合到所述多糖聚合物链的核酸传递侧链，其中，所述一个或多个核酸传递 侧链还含有阳离子肽。在本发明的第一方面的一种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物 还含有一个或多个物理键合到所述阳离子肽的核酸以形成多糖核酸复合体。
[0010]在一种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发明的第一方面的上述 实施方式中的任意一种或多种，其中，所述多糖聚合物链含有葡聚糖，纤维素，淀粉，葡萄 糖胺聚糖（glycosaminoglycans)，甘露聚糖，糊精，琼脂，琼脂糖（agarose)，藻酸，多糖 酸（alguronic acid)，直链淀粉，a-葡聚糖，支链淀粉，葡聚糖，胼胝质，角叉菜胶， 纤维糊精，壳多糖，脱乙酰壳多糖，金藻昆布多糖（chrysolaminarin)，环糊精，DEAE-琼脂 糖，聚鹿糖，果聚糖，褐藻糖胶（fucoidan)，半乳葡甘露聚糖（galactoglucomannan)，半乳 甘露聚糖，结冷胶（gellan gum)，葡聚糖，葡甘露聚糖，葡糖醛酸，糖萼，糖原，半纤维素，同 聚多糖，羟丙甲纤维素，菊粉，海带多糖（laminarin)，香菇多糖，果聚糖多糖，地衣淀粉， 混合联动葡聚糖，裸藻淀粉（paramylon)，果胶酸，果胶，喷他淀粉（pentastarch)，藻糖原 (phytoglycogen)，平燕0 -葡聚糖（pleuran)，聚右旋糖，多糖肽，卟啉，普鲁兰多糖，琼脂 糖凝胶（sepharose)，木聚糖，木葡聚糖，酵母聚糖，透明质酸，肝素或它们的组合。在一种或 多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发明的第一方面的上述实施方式中的任意一 种或多种，其中，所述多糖聚合物链可具有约500道尔顿至约1，000, 000道尔顿的重均分子 量。
[0011] 在一种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发明的第一方面的上述实 施方式中的任意一种或多种，其中，所述一个或多个核酸传递侧链还含有甲基丙烯酸酯，丙 烯酸酯，甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酰胺，丙烯酰胺，马来酰亚胺，卤乙酰，和吡啶基二硫化物， 硫醇或它们的组合。
[0012] 在一种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发明的第一方面的上述实 施方式中的任意一种或多种，其中，每个所述一个或多个核酸传递侧链上的阳离子肽为具 有选自由 CWR5, CWR3H3, CWK5, CWK3, CWR5H5, CWR3H3, CWK5H5, CWK3H3,（；!?"，CwKn，GH，C wKpHq，或者 CwRxKyHz组成的组的结构式的无规共聚物；其中，C是半胱氨酸，R是精氨酸，K是赖氨酸，H 是组氨酸，并且m，n，〇, p，q，x，y，z和w是1至1000的整数。在一种或多种实施方式中， 多糖聚合物组合物可含有本发明的第一方面的上述实施方式中的任意一种或多种，其中， 每个所述一个或多个核酸传递侧链上的阳离子肽为具有选自由CR 5, CR3H3, CH3R3, CK5, CK3， CH5R5(SEQ. ID No. 1)，CR5H5(SEQ. ID No. 2)，CR3H3, CH3R3, CK5H5(SEQ. ID No. 3)，CH5K5(SEQ. ID No. 4)，CK3H3, CH3K3, R5C，R3H3C，K5C，K3C，R 5H5C(SEQ. ID No. 5)，R3H3C，K5H5C(SEQ. ID No. 6)， K3H3C，OC CKn，CH，CKpHq，或CRxKyH z组成的组的结构式的嵌段共聚物；其中，C是半胱氨酸， R是精氨酸，K是赖氨酸，H是组氨酸，并且m，n，〇, p，q，x，y，z和w是1至1000的整数。
[0013] 在一种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发明的第一方面的上述实 施方式中的任意一种或多种，其中，所述阳离子肽含有约1至约10000个精氨酸残基，约1 至约10000个组氨酸残基和至少一个半胱氨酸残基。在一种或多种实施方式中，多糖聚合 物组合物可含有本发明的第一方面的上述实施方式中的任意一种或多种，其中，所述阳离 子肽含有约1至约10000个赖氨酸残基，约1至约10000个组氨酸残基和至少一个半胱氨 酸残基。在一种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发明的第一方面的上述实 施方式中的任意一种或多种，其中，所述阳离子肽具有结构式NH 2-RRRRRHHHHHC-C00H(SEQ. ID No. 5)〇
[0014] 在一种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发明的第一方面的上述实 施方式中的任意一种或多种，其中，所述一个或多个核酸传递侧链还含有结合到所述多糖 聚合物链上的连接分子，其中，所述阳离子肽通过硫醇键键合到所述连接分子上。
[0015] 在一种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发明的第一方面的上述实 施方式中的任意一种或多种，其中，多糖核酸复合体具有约1:1至约1〇〇:1的N/P比。在一 种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发明的第一方面的上述实施方式中的任 意一种或多种，其中，多糖核酸复合体具有约1:1至约10:1的N/P比。
[0016] 在一种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发明的第一方面的上述实 施方式中的任意一种或多种，其中，所述一种或多种核酸含有核糖核酸，脱氧核糖核酸或它 们的组合。在一种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发明的第一方面的上述 实施方式中的任意一种或多种，其中，所述一种或多种核酸含有选自由质粒DNA，寡核苷酸， 适体，DNA核酶，RNA适体，RNA诱饵，反义RNA，核酶，小干扰RNA (siRNA)，microRNA (miRNA)， 短发夹RNA，miRNA诘抗剂（Antagomirs)，和它们的组合。
[0017] 第二方面，本发明涉及任意一种或多种上述第一方面的多糖聚合物组合物，其还 含有一个或多个两性离子侧链。在一种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发 明的第二方面的上述实施方式中的任意一种或多种，其中，所述一个或多个两性离子侧链 还含有两性离子基团，所述两性离子基团含有羧基甜菜碱基团，磺基甜菜碱基团，磷基甜菜 碱基团或者它们的任意组合。在一种或多种实施方式中，多糖聚合物组合物可含有本发明 的第二方面的上述实施方式中的任意一种或多种，其中，所述两性离子基团具有相应的阳 离子环的形状。
[0018]第三个方面，本发明涉及任意一种或多种上述第一和第二方面的多糖聚合物组合 物，其还含有一个或多个反应性侧链，该反应性侧链含有选自由丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯， 甲基丙烯酰胺，丙烯酰胺，马来酰亚胺，卤乙酰（haloacetyls)，吡啶基二硫化物，硫醇和它 们的组合组成的组的化合物。
【附图说明】
[0019] 为了更完整地理解本发明的特征和优点，现结合本发明的附图对其进行如下的详 细描述：
[0020] 图1为根据本发明的一种或多种实施方式的重水（D20)中Dexl0_R 5H5(20% )的 300MHz 虫 NMR 图谱。
[0021] 图2为根据本发明的一种或多种实施方式的重水（D20)中Dexl0_R 5H5(40% )的 300MHz 虫 NMR 图谱。
[0022] 图3为根据本发明的一种或多种实施方式的重水（D20)中Dex20_R 5H5(10% )的 300MHz 虫 NMR 图谱。
[0023] 图4为根据本发明的一种或多种实施方式的重水（D20)中Dex20_R 5H5(20% )的 300MHz 虫 NMR 图谱。
[0024] 图5为根据本发明的一种或多种实施方式的重水（D20)中Dex70_R 5H5(10% )的 300MHz 虫 NMR 图谱。
[0025]图 6A-E 的图像分别显示了在 N/P 比为 0，1，5，10,20 和 30 下，Dexl0-R5H5(20% )/ DNA(6A),Dexl0-R5H5(40%)/DNA (6B),Dex2〇-R5H5 (10%)/D NA (6C),Dex2〇-R5H5 (20% )/ DNA(6D)和Dex70-R5H5(10% )/DNA(6E)复合体中的DNA的电泳迀移率检测的结果。
[0026]图 7A-B 显示了由（7A) Dexl〇-R5H5 (20 % ) /DNA ( 0 ):, Dexl〇-R5H5 (40 % ) /DNA (興， Dex20-R5H5(10% )/DNA(?)，和 Dex20-R5H5(20% )/DNA(目）和（7B)Dex70-R5H5/DNA 在 SK0V3 细胞株系中诱导的荧光素酶的表达水平的柱状图，在N/P为5下的DNA和PEI-DNA分别用 作阴性对照和阳性对照，误差棒表示4个重复的标准偏差。*，**P〈0. 05。
[0027] 图8A-B显示了 N/P为5的DNA和PEI-DNA复合体与不同N/P比的（8A) Dexl0-R5H5(20% )/DNA：(MDexl〇-R5H5 (40% )/DNA( ? ),Dex2〇-R5H5(10% )/DNA|H)^P Dex20-R5H5 (20 % ) /DNA;(:目):复合体和（8B) Dex70-R5H5/DNA孵育后的SK0V3细胞株系的细胞 存活率比较的柱状图，DNA浓度为5yg/mL，误差棒表示8个重复的标准偏差。*，**P〈0. 05。
[0028] 图9为显示miRNA拮抗剂与Dexl〇-R5H 5 (40% )在不同N/P下复合以及与RNAiMAX 在设定比下按照其方法复合的电泳迀移率检测的结果图。
[0029] 图10为HepG2细胞中的Dex_R5H 5/microRNA复合体的细胞内定位检测图，显示了 孵育6小时后，在N/P比为1、2和4的Dexl0k-R 5H5(40% )/miRNA149抑制剂复合体的制剂 和在预定比下按照RNAiMAX方法的RNAiMAX/miRNA149拮抗剂复合体的细胞的内在化。用 TM-罗丹明（红色）染色miRNA，并用Hoechst 33342(蓝色）染色细胞核。每个样品测得 的焚光强度表不为总红色焚光值/细胞。误差棒表不4个重复的标准偏差。
[0030] 图11为显示用所示的制剂孵育48小时后的相对miRNA 149水平的柱状图，U6的 miRNAs用作内标，所有miRNA表达水平标准化为对照（无处理）。误差棒表示4个重复的 标准偏差。*P〈〇. 05。
[0031]图12为显示用不同的药物制剂（在N/P比为1、2和4下Dexl0-R5H5(40%)与 miRNA149抑制劑或miRNA NC的复合和在预定比下按照其方法RNAiMAX与miRNA149拮抗剂 或miRNA NC的复合）孵育24小时后的IfepG2细胞的细胞存活率的柱状图。
【具体实施方式】
[0032] -般地，根据本发明的多种实施方式的用于核酸传递的新的组合物涉及一组具有 一个或多个含有阳离子肽的核酸传递侧链的多糖聚合物。在某些实施方式中，这些阳离子 肽凝结并物理键合到核酸上以形成允许核酸传递并转染进细胞内的多糖核酸复合体。在 某些实施方式中，本发明的多糖聚合物也可具有一个或多个两性离子侧链和/或反应性侧 链。
[0033] 根据本发明的多种实施方式的用于核酸传递的多糖聚合物组合物含有多糖聚合 物链和一个或多个通过连接分子的方式将一个或多个阳离子肽键合到多糖聚合物链而形 成的核酸传递侧链。多糖聚合物链（在此也指多糖聚合物主链或聚合物主链）是生物相 容的和可生物降解的。在某些实施方式中，这些多糖聚合物链可具有一