Myf6启动子驱动肌肉组织MyoD基因的表达应用

Myf6启动子驱动肌肉组织MyoD基因的表达应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及Myf6启动子驱动肌肉组织MyoD基 因的表达应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是基因表达调控的重要顺式元件，也是基因工程表达载体的一个重要组 成部分。RNA聚合酶和转录因子可以识别并结合启动子上特定DNA序列，从而起始转录 (Landolin et al 2010)。随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白 质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件 (李珊珊等，2005)。
[0003] 转基因技术始于20世纪70年代，是科研人员按照需要将外源目的基因导入宿主 细胞中，使外源基因稳定地整合在宿主基因组中，随着宿主基因组的复制而扩增，得到稳 定的遗传和表达。原核显微注射法是将在体外构建的目的基因在显微操作仪下用极细的 微吸管直接注射到处于原核时期的受精卵的原核中，当受体受精卵在进行DNA合成或修复 时，把外源基因整合到基因组中。科学家曾成功地将小鼠的启动子与大鼠的生长激素基因 用原核显微注射的方法构建了转基因"超级鼠"，显示了转基因动物技术人为改造物种或生 物性状的可能性（Palmiter et al, 1982)。有研究表明，外源基因在转基因小鼠中可以稳定 的传至第七代（Wang et al, 2009)。
[0004] 中国是猪肉生产和消费大国，猪肉的消费约占肉类消费的64%，因此，优良猪品种 的培育对养殖业的发展具有重要意义。常规育种技术曾在猪的品种改良方面发挥了巨大作 用，但是存在选择周期长、遗传进展较慢等不足。现代动物分子育种中，利用分子标记技术 可以对动物后代进行快捷可靠地筛选（魏景亮等2014)。但是，其改良的程度依然受限于 品种自身已有的基因。利用转基因技术可直接对受体动物的基因组进行遗传修饰，从而创 造出新性状或新品种。因此，转基因技术与常规育种相结合，是今后优质猪种培育发展的方 向。
[0005] 本发明是基于华中农业大学申请的公开号为103421781A，名称为（猪肌肉组织 特异性表达基因myf6启动子及应用）基础上的后续研究。本发明通过构建真核表达载体 pSV40-Myf6-MyoDEGFP-Nl并将其进行线性化处理，所述的线性化载体片段包括：猪肌肉组 织特异性基因Myf6的启动子、猪肌肉组织特异性基因MyoD、标签基因EGFP、SV40 polyA序 列、SV40增强子序列。真核表达载体pSV40-Myf6-My〇DEGFP-Nl的构建流程如图1，线性化 片段的序列见附录，线性化的外源基因利用原核显微注射技术制备转基因小鼠。
[0006] 到目前为止，关于猪肌肉组织特异性基因Myf6的启动子（本文简称为Myf6启动 子），驱动猪的肌肉组织特异性基因MyoD的表达在模式动物小鼠中的研究并未发表过。所 以申请人在转基因鼠活体水平上验证猪肌肉组织特异性基因Myf6的启动子是否可以驱使 猪的肌肉组织特异性基因MyoD的上调表达，从而影响肌纤维的生长状况。期望通过活体水 平验证猪的肌肉组织特异性基因Myf6的启动子活性，为日后生产中制备转基因猪提供功 能性启动子，从而为提高猪的瘦肉率提供技术基础。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的在于利用Myf6启动子驱动肌肉组织MyoD基因的表达应用。本发明 通过制备转基因小鼠，对来源于猪肌肉组织特异性基因Myf6的启动子是否可以驱动猪的 肌肉组织特异性基因MyoD的上调表达在活体水平上进行了相关生物学验证，旨在获得具 有活性的猪肌肉组织特异性启动子，为以后制备转基因猪，提高猪的瘦肉率提供技术基础。
[0008] 申请人通过在转基因小鼠活体水平上验证猪肌肉组织特异性基因Myf6的启动子 活性，获得的结果表明Myf6启动子虽然没有驱使转基因鼠骨骼肌中MyoD基因的上调表达， 但是通过对转基因鼠不同组织表达谱的构建表明MyoD基因是在肌肉组织中特异性高表 达，并且可以改变转基因鼠的肌纤维的生长状况，使肌束的面积和直径都显著高于野生型 鼠，其单位面积内肌纤维数量显著低于野生型鼠。本发明最终获得功能性猪肌肉组织特异 性启动子Myf6,为日后生产中制备转基因猪提供了功能性启动子。
[0009] 具体地，本发明通过以下技术方案实现：
[0010] 本发明以公开号为103421781A(发明名称为：猪肌肉组织特异性表达基因myf6启 动子及应用）的专利文献为研究基础，构建得到真核表达载体pSV40-Myf6-My 〇DEGFP-Nl并 且进行线性化处理，将获得的外源片段（见序列表SEQ ID N0 :1所示的序列）利用显微注射 的方法制备转基因鼠。通过PCR扩增外源片段的全长序列鉴定阳性转基因鼠，再通过绝对 定量PCR鉴定外源基因在转基因鼠基因组中的拷贝数，利用荧光定量PCR和Western blot 方法分别在mRNA水平和蛋白水平鉴定转基因鼠骨骼肌中MyoD基因的表达情况以及利用荧 光定量PCR在mRNA水平鉴定MyoD基因在转基因鼠不同组织中的表达情况，通过对转基因 鼠骨骼肌横切面切片染色分析肌束的生长状况。
[0011] 本发明的具体步骤是：
[0012] (1)真核表达质粒 pSV4〇-Myf6-MyoDEGFP_Nl 的构建
[0013]在GenBank中提取MyoD的CDS序列（序列见SEQ ID N0 :3)，序列号为 NM_001002824. 1，设计带有酶切位点的引物扩增MyoD基因的cDNA (见图3)，回收后，连接到 PMD-18T载体（购自宝生物工程大连有限公司）上，测序结果与NCBI上猪的MyoD⑶S序列 进行Blast比对，吻合度为100%，即成功得到MyoD基因的⑶S序列，采用Hind III/Kpn I 进行酶切鉴定pMD-My〇D-18T质粒（见图4)。然后将去除终止密码子的MyoD⑶S序列连接 到pEGFP-Nl中，得到中间载体pMy 〇DEGFP-Nl，酶切鉴定（见图5)，进行测序，结果为正确。 以公开号为CN103421781A的专利中pGL3-basic-Ql质粒为模板，扩增SV40-Myf6序列（即 Myf6基因的启动子序列，该序列见SEQ ID N0 :5,扩增结果见图6)，将SV40-Myf6的PCR产 物及中间载体pMyoDEGFP-Nl采用Ase I/Hind III进行双酶切（见图7)，将SV40-Myf6序 列插入到中间载体Ase I/Hind III之间。采用限制内切酶Ase I/Hind III进行酶切鉴定， 切出两条带，与预期大小1671bp和5072bp -致（见图8)，结果为正确，即成功构建肌肉特 异表达载体pSV40-Myf6-MyoDEGFP-Nl。为后续制作肌肉特异表达MyoD转基因小鼠，将肌肉 特异性表达载体pSV40-Myf6-My 〇DEGFP-Nl进行线性化鉴定，采用的酶Ase I/Af 1 II，切出 与预期大小一致的3643bp和3100bp (见图9)，回收3643bp片段，即可用作显微注射（结果 见图10中的A图）。
[0014] (2)后代阳性转基因鼠的鉴定
[0015] 以后代转基因鼠的基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增外源序列（见SEQIDN0: 2,序列长度为3632bp)的全长片段鉴定为阳性转基因鼠（见图10中的B图）。
[0016] (3)外源基因在转基因鼠基因组中的拷贝数鉴定
[0017] 根据文献获知小鼠的甲状旁腺激素样激素基因Pthlh在小鼠基因组上属于单拷 贝基因，我们设计带有Nhe I和Bglll酶切位点的引物从小鼠基因组上扩增Pthlh基因的 部分序列（见图11，序列见SEQ ID N0 :6)，胶回收Pthlh扩增片段，再分别酶切Pthlh回收 产物和pGL3-Basic载体，酶切结果见图12,再利用T4连接酶将Pthlh片段和pGL3-Basic 载体连接构建pGL3-Pthlh-Basic重组质粒，然后利用酶切和测序鉴定重组质粒（见图13)，
[0018] 利用绝对定量PCR方法绘制标准曲线（图14)，并对F0、FI、F2和F3代转基因鼠 基因组中外源基因的拷贝数进行鉴定。结果表明，随着转基因鼠的传代，外源基因的拷贝数 逐渐增加（表2)，从而证明外源基因可以稳定的整合到转基因鼠基因组上并且可以稳定遗 传给后代。
[0019] (4)利用荧光定量PCR方法鉴定转基因鼠肌肉组织MyoD基因RNA水平的表达
[0020] 首先对同日龄同性别的转基因鼠和非转基因鼠的骨骼肌提取RNA，通过荧光定量 PCR方法鉴定鼠骨骼肌中MyoD的表达量情况，结果表明转基因鼠骨骼肌中MyoD的表达量高 于野生型鼠骨骼肌中MyoD的表达量，但不存在显著性差异。然后利用荧光定量PCR对同窝 同性别的转基因阳性鼠进行组织表达谱的构建，结果表明，MyoD基因特异性的在肌肉组织 中高表达（图15)，并且转基因鼠骨骼肌中MyoD的表达量高于野生型鼠（图16)，但是不存 在显著性差异。
[0021] (5)利用Western Blot方法鉴定转基因鼠骨豁肌中MyoD蛋白的表达情况
[0022] 对同日龄同性别的转基因鼠和野生型鼠的骨骼肌组织提取MyoD蛋白（蛋白质序 列见SEQ ID N0 :4)，通过Western Blot方法鉴定转基因鼠骨骼肌中MyoD蛋白的表达情况。 结果表明转基因鼠肌肉组织中MyoD蛋白的表达高于野生型鼠（见图17)。
[0023] (6)小鼠生长状况的测定
[0024] 对出生后1到8周龄的转基因阳性鼠与野生型鼠进行体重称量，分别对公鼠与母 鼠的体重进行分析，每组小鼠样本数至少为三只，每周体重称量所得数据经过t检验分析， 最终绘制生长曲线（见图18)。
[0025] (7)转基因鼠骨骼肌横切切片的HE染色分析肌束的生长状况
[0026] 制备转基因鼠和野生型鼠骨骼肌的横切切片，HE染色，显微镜下采集图片（见图 19)。分析肌束的生长状况。结果表明转基因鼠的肌束横截面积和直径都显著性大于野生 型鼠（见图20中的A图、图20中的B图），而单位面积内的肌束密度显著性低于野生型鼠 (图20中的C图）。
[0027] 本发明的优点在于：
[0028] (1)本发明首次在活体水平上验证了猪肌肉组织特异性基因Myf6的启动子的活 性及组织特异性，证明Myf6启动子可以驱使MyoD基因特异性的在肌肉组织中高表达。
[0029] (2)本发明验证了猪的肌肉特异性启动子Myf6可以上调肌肉特异性基因MyoD的 表达，进而促进肌细胞的生长，为日后生产中通过制备转基因猪来提高猪的瘦肉率提供了 技术基础。
[0030] 更详细的技术方案参见《【具体实施方式】》的内容。
【附图说明】
[0031] 序列表SEQIDN0 :1是用于显微注射的线性化质粒序列，序列长度为3649bp。
[0032] 序列表SEQ ID NO :2是PCR技术验证阳性转基因鼠扩增的外源全长片段序列，序 列长度为3632bp。
[0033] 序列表SEQ ID NO :3是猪MyoD基因CDS序列，序列长度为960bp;编码319个氨 基酸。
[0034] 序列表SEQIDN0 :4是猪MyoD基因编码的蛋白质序列。
[0035] 序列表SEQIDN0 :5是本发明扩增的Myf6基因的启动子序列（或称为 SV40-Myf6)，序列长度为 1683bp。
[0036] 序列表SEQ ID NO :6是用于重组质粒pGL3-Pthlh_Basic构建的小鼠单拷贝基因 Pthlh的部分核苷酸序列，序列长度为91bp。
[0037] 图1:是本发明的肌肉特异性表达载体（或称重组表达质粒） pS