一种人感染h7n9禽流感病毒全基因组序列及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学生物检测技术领域，具体是指一种人感染H7N9禽流感病毒全基 因组序列及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 2013年3月首先在我国上海、安徽发现人感染H7N9禽流感病例（Gao RB，Cao B，Hu Yff, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus[J]. N Engl J Med, 2013, 368 (20) : 1888-1897. DOI: 10. 1056/NEJMoal304459.)，截止 2015 年 1 月 31日，在我国16个省（直辖市）的246个县区累计发现552例人感染H7N9禽流感病例，死 亡208例，病亡率高达37. 7%，给我国农业经济和人民健康带来巨大影响。目前，病例仍呈 散发状态，但个别地区呈现地理分布聚集性，且疫情有东南沿海向内陆更多地区发展的趋 势。
[0003] 为何人感染H7N9禽流感疫情在我国持续流行，其内在基因发生怎样的遗传变异 和重组，需要我们去揭示更多的相关分子流行病学特征。为了更好的评估H7N9禽流感大 流行的风险，有专家甚至联名呼吁应进行H7N9禽流感病毒功能获得性突变试验，进一步 研究病毒宿主范围、毒力、传播途径、耐药性等（Fouchier RA，Kawaoka Y，Cardona C，et al. Gain-〇f-function Experiments on H7N9[J]. Science, 2013, 341(6146):612-613. DOI: 10. 1126/science. 341. 6146. 612.)，然而所有这一切研究的基础就是获得病毒的全基 因组序列，本次研究建立了人感染H7N9禽流感病毒8个节段全基因组扩增与测序方法，可 为其分子生物学深入研究奠定基础。
[0004] 人感染H7N9禽流感病毒是首次在人群中发现的新型禽流感病毒，其8个基因 重组来源较为复杂，有研究表明其HA基因来源于鸭A/duck/Zhej iang/12/2011 (H7N3) 禽流感病毒、NA基因来源于候鸟A/wild bird/Korea/A14/2011(H7N9)病毒、其余6 个内部基因可能起源于2个不同群组的H9N2禽流感病毒（Gao RB，Cao B，Hu YW，et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus [J]. N Engl J Med,2013, 368 (20):1888-1897.DOI:10. 1056/NEJMoal304459.Fouchier RA, Kawaoka Y,Cardona C, et al.Gain-〇f-function Experiments on H7N9 [J]. Science, 2013, 341 (6146):612-613. DOI:10. 1126/science. 341. 6146. 612. ffeng YH, Zhang YJ，Xie JF，et al. Confirmation of first case of human infection with influenza A(H7N9)virus in Fujian Province:laboratory diagnosis and viral sequence analysis[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(6) :543_546. (in Chinese)翁育伟，张拥军，谢 剑锋，等.福建省首例人感染H7N9禽流感病例实验室诊断和病毒序列分析[J].中国人兽 共患病学报，2013, 29(6) :543_546. Liu D, Shi WF, Shi Y，et al. Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9viruses causing human infection:phylogenetic structural, and coalescent analyses [J].Lancet, 2013, 381 (9881) : 1926-1932. DOI:10. 1016/S0140-6736(13)60938-1.)。
[0005] 目前H7N9禽流感病毒主要的基因突变如下：
[0006] (1) HA基因主要发生Q226L变异（以H3位点来计算），从而使病毒获得与人上呼吸 道上皮细胞SA a -2,6Gal受体结合的能力，使病毒更易感染到人。其中，经过本方法分析的 H7N9禽流感毒株HA基因的受体位点结合出中还出现A134V的变异，亦是H7N9禽流感突破 宿主屏障，感染至人的分子基础，该位点的变异是否在病毒中稳定存在并对流行产生影响， 需进一步深入分析。从抗原性分析上来看，2013-2015年H7N9禽流感病毒未见明显改变，但 值得注意的是，2014年12月以来的毒株均发生L177I变异，该位点突变的意义以及突变是 否与本次新一轮流行有关，需进一步进行分析。本次分析的所有H7N9禽流感毒株的HA裂 解位点中氨基酸序列均呈现为PEIPKGRG，即HA裂解位点中只含两个碱性氨基酸赖氨酸K与 精氨酸R，未出现多个连续的碱性氨基酸，表现为低致病性。
[0007] (2)PB2基因中的相关位点在宿主特异性中也起到重要作用。当PB2含627K时， 可在人体中有效进行病毒蛋白合成功能，而含627E会限制其合成。本次分析的毒株大部分 均表现出E627K的变异，且有1株还出现D701N变异，这均提高了病毒在宿主中的合成与扩 散。
[0008] (3)在所有毒株的M2蛋白中均有S31N变异，提示病毒均对离子通道抑制剂类药物 (烷胺类药物）不敏感。通过对神经氨酸酶（NA)分析发现所有病毒均未出现E120G、R153K、 H276Y、R294K这些重要酶作用位点的变异，且酶活性中心及周围相关位点也未发现变异，故 病毒对神经氨酸酶抑制剂是敏感的
[0009] (4)通过该方法分析的H7N9毒株中还发现：HA基因的D225G突变、NA基因中缺失 69-73位氨基酸、Ml基因的N30D突变、PA基因的A36T突变、PB1基因的I368V突变、PB2的 L89V突变和NS1的P42S突变，这些均提示了 H7N9病毒有毒力增加的表现。
[0010]目前，为了探寻H7N9禽流感这一人间新发传染病的来龙去脉，许多学者都 致力于基因特征研究，重点对其遗传性、抗原性、致病性、耐药性、毒力、传播力等特征 (Zhang H, Li XY,Guo J, et al. The PB2E627K mutation contributes to the high polymerase activity and enhanced replication of H7N9influenza virus[J]. J Gen Virol,2014 (95):779 - 786. DOI:10.1099/vir. 0.061721-0. Sleeman K, Guo Z,Barnes J, et al. R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses[J]. Emerg Infect Dis,2013,19 (9):1521-1524. DOI:10. 3201/eidl909. 130724. Neumann G, Macken C A, Kawaoka Y, et al. Identification of amino acid changes that may have been critical for the genesis of A(H7N9)influenza viruses[J]. J Virol, 2014, 88 (9):4877-4896. DOI:10. 1128/JVI. 00107-14.)进行深入分析，然而，要获得 这些相关基因信息的基础就是需成功完成H7N9禽流感全基因组的扩增和测序。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供一种便捷获得人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列的方 法，人感染H7N9禽流感病毒全基因组全长包括8个基因节段，共计约13103个核苷酸。 [0012] 以前已有禽流感H7的疫苗，但与此次流行的H7N9禽流感病毒不匹配，临床上评估 H7N9疫苗代表株的安全性和免疫原性是必须的，这需要一个较长的过程。常规的疫苗研发 均是用反向遗传技术对病毒重要免疫原性的基因片段进行重组，这势必要求我们首先获得H7N9禽流感病毒的全基因组序列，从而能为重组的疫苗生产奠定基础。
[0013]目前，针对人感染H7N9禽流感病毒的治疗主要依赖于神经氨酸酶抑制剂（如奥司 他韦或扎那米韦等），通过全基因组分析能较快的从基因特征中分析病毒的耐药特征，从而 能为临床救治病例提供参考依据。
[0014] 本发明的另一目的在于提供上述人感染H7N9禽流感病毒全基因组序列扩增引 物，所述扩增引物如SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:44所示，共22个引物对。
[0015] 其中22个引物对序列如下：
[0060] 本发明又一目的在于提供一种制备上述人感