一种木聚糖酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于酶基因改造技术领域，具体涉及一种木聚糖酶突变体及其应用。
【背景技术】
[0002]木聚糖(xylan)广泛存在于自然界中，是半纤维素的重要组分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。在被子植物中木聚糖占干物质重的15%?30%，在裸子植物中占干物质重的7%?12%。但木聚糖具有很强的抗营养作用，在动物的消化道内不能被消化和吸收，而且会影响其它养分的吸收利用，因而大大限制了富含木聚糖饲料(大麦、小麦、黑麦等)的应用。木聚糖酶(Xylanase)是指能专一降解半纤维素木聚糖为低聚木糖和木糖的一组酶的总称。人们对木聚糖酶的研究早在六十年代就已开始，主要研究集中在食品、饲料、造纸、能源工业等方面的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶。并分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。
[0003]因为目前在颗粒生产过程中有一个短暂的80?90°C的高温阶段。青霉菌来源木聚糖酶热稳定性较差，其水溶液在65°C下保温5分钟剩余酶活性低于30%，使该酶在颗粒饲料的应用受到限制。采用饲料制粒后木聚糖酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且对酶制剂的稳定性、饲料中分布均一性都无法很好的保证。因此，提高木聚糖酶热稳定性对目前饲料用木聚糖酶具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种耐热木聚糖酶突变体及其应用。申请人通过对来源于绳状青霉(Penicillium funiculosum)的木聚糖酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白，其耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的广泛应用。
[0005]本发明一方面提供了一种木聚糖酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的木聚糖酶的第115位氨基酸由Asp突变为Glu。
[0006]上述木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO: 3，其一种编码核苷酸序列为SEQID N0:4o
[0007]本发明另一方面提供了一种木聚糖酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID N0:3的木聚糖酶突变体的第102位氨基酸由Thr突变为Pro。
[0008]上述木聚糖酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO: 5，其一种编码核苷酸序列为SEQID N0:6o
[0009]本发明还提供了上述木聚糖酶突变体在饲料中的应用。
[0010]本发明提供了木聚糖酶突变体XynDl和XynD2，并构建得到重组表达木聚糖酶突变体的毕赤酵母工程菌XynDl和毕赤酵母工程菌XynD2，其1L发酵罐的发酵水平能分别达到7415U/ml和7508U/ml。所述木聚糖酶突变体的最适作用pH值均为5.5，与野生型木聚糖酶XynPF—致，但最适作用温度为60°C，且比野生型木聚糖酶具有更强的耐热性。其中，木聚糖酶突变体XynDl在65°C条件下处理5min后能保持45%以上的酶活，在70°C、75°C条件下处理5min后仍能分别保持30%和25%左右的酶活，木聚糖酶突变体XynD2在65°C条件下处理5min后能保持75%以上的酶活，在70°C、75°C条件下处理5min后仍能分别保持35%和30%左右的酶活。所述木聚糖酶突变体可广泛应用于饲料领域，前景广阔。
【附图说明】
[0011]图1为木聚糖酶突变体XynDl和XynD2耐热性比较图。
【具体实施方式】
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[0012]本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook,2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR B1LOGY (AusubeI, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
[0013]实验材料和试剂:
[0014]菌株与载体:大肠杆菌DH5a、毕赤酵母GS115、载体pPIC9K、Amp、G418购自Invitrogen 公司。
[0015]酶与试剂盒:PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
[0016]培养基配方:
[0017]大肠杆菌培养基(LB培养基):0.5%酵母提取物，I %蛋白胨，1% NaCl，pH7.0)；
[0018]LB-AMP培养基:LB培养基加100 μ g/mL氨苄青霉素；
[0019]酵母培养基(YPD培养基):I %酵母提取物，2 %蛋白胨，2 %葡萄糖；
[0020]酵母筛选培养基(MD培养基):2%葡萄糖，2%琼脂糖，1.34% YNB (无氨基酵母氮源)，4X105生物素；
[0021]BMGY培养基:2%蛋白胨，I %酵母提取物，10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34 %YNB (无氨基酵母氮源)，4 X 10 5生物素，I %甘油；
[0022]BMMY培养基:2%蛋白胨，I %酵母提取物，10mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34 %YNB (无氨基酵母氮源)，4 X 10 5生物素，0.5 %甲醇。
[0023]下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0024]实施例1木聚糖酶基因的扩增
[0025]XynPF-Fl: GCTGTTACATCCAACGAGACCGG
[0026]XynPF-Rl:TTAAGAGACGGTAATAGTAGAAG
[0027]以绳状青霉(Penicillium funiculosum)基因组为模板，利用上述引物XynPF-Fl和XynPF-Rl进行PCR扩增，胶回收PCR产物，连接pEASY_T载体，转化至大肠杆菌DH5a中，挑取正确的转化子进行测序。测序结果显示，转化子中木聚糖酶的核苷酸序列为SEQ IDNO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，申请人将该木聚糖酶命名为XynPF。
[0028]实施例2木聚糖酶突变体基因的扩增及合成
[0029]为了提高木聚糖酶XynPF的耐热性，通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物XynPF-F2、XynPF_R2如下:
[0030]XynPF-F2:GGCGAATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCGG (下划线为限制性内切酶 EcoRI识别位点)
[0031 ] XynPF-R2:ATAGCGGCCGCTTAAGAGACGGTAATAGTAGAAG (下划线为限制性内切酶 NotI识别位点)
[0032]以XynPF基因(SEQ ID NO:2)为模板，利用上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI, Not I进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mMIPTG的LB+Amp培养基，37°C 220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有木聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
[0033]分别取出30ul裂解液至两块新的96孔板；将其中一块于75°C处理5min ;然后将两块96孔板都加入30ul底物，于37°C反应30min后，DNS法测定生成的还原糖，计算不同突变子高温处理后的酶活水平。实验结果表明，有些突变对木聚糖酶的耐热性没有影响，有些突变甚至使其耐热性或酶活变得更差了 ；另外还有些突变，虽然能提高木聚糖酶对温度的耐受性，但突变后其酶学性质发生了显著的变化，这些均不符合要求。最终，申请人得到既能显著提高木聚糖酶XynPF的耐热性，又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点及位点的组合:D115E单点突变和T102P、D115E两点突变。
[0034]将含Dl 15E单点突变的木聚糖酶突变体命名为XynDl，其氨基酸序列为SEQ IDNO:3，编码核苷酸序列为SEQ ID N0:4;含T102P、D115E两点突变的木聚糖酶突变体命名为XynD2，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:6。以上核苷酸序列由上海捷瑞生物公司合成。
[0035]用引物XynPF_F2、XynPF_R2对上述两个突变体进行PCR扩增，引物两端引入EcoR1、Not I位点。PCR反应条件为:94°C变性5min ;然后94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸lmin，30个循环后，72°C保温lOmin。琼脂糖凝胶电泳结果显示，XynDl和XynD2的基因片段大小均为570bp。
[0036]通过上述同样的PCR方法扩增得到野生型木聚糖酶XynPF的基因片段。
[0037]实施例3毕赤酵母工程菌株的构建
[0038]将上述克隆得到的木聚糖酶突变体基因XynDl和XynD2片段，通过Ec