GH61家族糖苷水解酶基因PpGH61及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从真菌中分离的GH61家族糖苷水解酶基因，尤其涉及一种从桧状青 霉（Penicillium piceum)中克隆得到的GH61家族糖苷水解酶基因及其cDNA序列，本发明 还提供了涉及含有该GH61家族糖苷水解酶cDNA序列的重组表达载体及重组宿主细胞，以 及它们在木质纤维素水解等的应用，属于真菌的功能基因的分离和应用领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着能源危机的加剧，可持续再生能源的研究成为当今研究热点。利用可 再生的纤维素资源生产生物乙醇（bioethanol)已成为克服能源危机的有效途径之一。在 生产生物乙醇的流程中，纤维素酶降解木质纤维素是整个过程的至关重要的一步。目前，纤 维素酶水解效率低下是纤维素乙醇（由木质纤维素转化生成的燃料乙醇）工业化生产的主 要瓶颈之一。除提高纤维素酶的本身活性外，一些具有促进纤维素酶活性的蛋白逐渐进入 人们的视野，如GH61糖苷水解酶家族蛋白。
[0003] GH61家族蛋白在水解过程中起的作用直到近年来才被认知。Thielavia terrestris的胞外酶液对木质纤维素和传统的糖苷水解酶底物无水解作用。但将 T.terrestris的发酵液与等量的里氏木霉（Trichoderma reesei)纤维素酶混合后，使 复合纤维素酶的总量减少一半仍能保证相同的水解效果。通过比较蛋白质组学分析，在 T.terrestris找到了 3个蛋白，可以显著提高纤维素酶水解效率（Harris et al. 2010)。这 一系列的酶由于具有具有微弱的内切葡聚糖酶活性，所以起初一直被作为糖苷水解酶。后 来发现GH61蛋白并不是传统意义上的糖苷水解酶，GH61蛋白的这种结构类似于CBM33家 族蛋白，被认为是CBM33家族的真菌类似物（Vaajc-Kolstad et al.2010)，但目前尚沿用 GH61糖苷水解酶这个名称。GH61家族糖苷水解酶在纤维素的水解中起着关键的作用。
【发明内容】
[0004] 发明人在已有桧状青霉9-3中克隆得到GH61家族糖苷酶编码基因，研究该基因 对水解的影响。通过与对照组相比，发现PPGH61糖苷水解酶基因与纤维素酶的机制不同， GH61蛋白虽然没有酶活，但是通过在木质纤维素水解过程中在固有酶系里添加GH61蛋白 能够促使其他纤维素酶发挥更高效力。本发明转基因验证了其功能，初步验证了 PPGH61基 因促使纤维素水解。
[0005] 鉴于上述状况，本发明目的之一在于提供一种从桧状青霉中克隆得到的GH61家 族糖苷酶编码基因PpGH61及其cDNA序列以及编码蛋白。
[0006] 本发明的另一目的在于构建一种涉及包括所述GH61家族糖苷酶PpGH61cDNA的重 组表达载体及重组宿主细胞。
[0007] 本发明的目的之三是将含有该GH61糖苷酶编码基因PpGH61或其cDNA应用于木 质纤维素水解等方面的作用。
[0008] 具体地，本发明提供的技术方案为：
[0009] -种具有促进纤维素水解功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列的碱基序列如（a) 或（b)或（c)或（d)所示：
[0010] (a)如 SEQ ID N0 :1 所示；
[0011] (b)如 SEQ IDN0 :2 所示；
[0012] (c)编码如SEQ ID N0 :3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0013] (d)在严谨杂交条件下与（a)或（b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有促进纤维 素底物水解功能的核苷酸序列。
[0014] -种具有促进纤维素水解功能的蛋白质，其氣基酸序列如SEQIDN0 :3所不。由 于氨基酸密码子存在简并性，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的 简并性（degeneracy)。对应于同一种氨基酸的不同密码子称为同义密码子（synonymous codon)。简并性使得那些即使密码子中碱基被改变，仍然能编码出原氨基酸。密码子的简 并性也使核苷酸分子上碱基组成有较大余地的变动。所以，本发明所述的核苷酸分子包括 但不限于以上的多核苷酸序列，还存在很多能够编码PPGH61蛋白的可能的多核苷酸序列， 这里不在一一列举。
[0015] -种载体，所述载体含有所述的核苷酸序列和与所述核苷酸序列可操作地连接的 用于表达的调节序列。本发明中使用的用于表达的调节序列可以使用多种适于该核苷酸序 列的表达载体，它们能够在多种真核宿主细胞和原核宿主细胞中表达。
[0016] 在本发明的其中一个实施例中，所述载体为PpGH61的敲除载体。所述基因敲除 载体包括GH61糖苷酶PpGH61DNA的上游1000bp-2000bp长度序列，抗性筛选基因，GH61 糖苷酶PPGH61DNA的下游1000bp-2000bp长度序列；其中，抗性筛选基因在GH61糖苷酶 PpGH61DNA的上游序列和下游序列中间。通过将该基因敲除载体转化至桧状青霉中得到重 组转化体，即GH61糖苷酶PpGH61基因功能缺失的突变体。
[0017] 本发明构建的PpGH61基因敲除载体包含PpGH61DNA序列的上下游同源重组片段， 利用重组质粒进行基因敲除时，目的基因就能被抗性筛选基因完全替换。
[0018] 对PpGH61敲除突变体的酶活以及水解效率测定结果表明，该基因的缺失并不影 响纤维素酶各个组分酶活以及蛋白分泌量。但是PPGH61敲除突变体的水解效率大大降低。
[0019] 宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的核苷酸序列、或所述的载体。该宿主细胞可以 与PpGH6同源或异源。
[0020] 在一个优选的实施方案中，该宿主细胞为里氏木霉细胞。
[0021 ] 在本发明的一个实施例中，一种获得所述的载体的方法，包括：
[0022] 利用 SEQ ID N0 :6 和 SEQ ID N0 :7 所示的引物序列，及 SEQ ID N0 :8 和 SEQ ID N0:9所示的引物序列，分别各自从桧状青霉（Penicillium piceum)9-3中克隆得到如SEQ ID NO :4和SEQ ID N0:5所示的两条核苷酸序列，并将所述两条多核苷酸序列分别各自连 接到敲除载体 pBS-Hygr (Liu XH，Lu JP，Zhang L，Dong B，Min H，Lin FC. Involvement of a Magnaporthe grisea serine/threonine kinase gene，MgATGl，in appressorium turgor and pathogenesis. Eukaryotic Cell 2007;6:997-1005.)上，以构建得到 PpGH61 基因的 敲除载体。
[0023] -种促进纤维素水解的方法，包括：
[0024] a?提供
[0025] (1)纤维素水解过程中的固有酶系；和，
[0026] (2)PpGH61蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0 :3所示；以及，
[0027] b.提供含有纤维素底物的样品，并使该含有纤维素底物的样品暴露于a中。
[0028] 优选的是，所述的促进纤维素水解的方法中，所述步骤a中，提供纤维素水解过程 中的固有酶系和PpGH61蛋白的具体步骤包括：
[0029] 步骤一、构建PpGH61基因过表达载体，并将其转化到里氏木霉中异源表达获得里 氏木霉PpGH61基因过表达菌株；
[0030] 步骤二、培养步骤一中得到的里氏木霉PpGH61基因异源过表达菌株并收集发酵 液；所述发酵液中含有纤维素水解过程中的固有酶系和PPGH61蛋白；
[0031] 所述b中，所述发酵液的用量按照该发酵液中的纤维素酶活为10IU/g纤维素底物 添加，使该含有纤维素底物的样品暴露于所述发酵液中。所述的核苷酸序列、所述的蛋白 质、所述的载体、或所述的宿主细胞用于促进纤维素底物水解的用途。
[0032] 所述的蛋白质用于在丝状真菌中寻找同源蛋白的用途。本发明提供了利用上述 PpGH61编码的蛋白质为目标，在NCBI数据库中搜索其他亲缘关系较近的丝状真菌中寻找 同源蛋白的思路上，如：黑曲霉（Aspergillus niger)，里氏木霉等。
[0033] 本发明所述的蛋白可具有多种蛋白变体，蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产 生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备转录因子的氨基酸 序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代 是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。
[0034] 本发明将克隆得到的GH61糖苷酶PpGH61eDNA或全基因可操作的与表达调控元件 相连接，构建获得重组表达载体，将重组表达载体转化到里氏木霉中异源表达，可以提高里 氏木霉的水解率。所述重组表达载体或表达盒包括启动子、PpGH61cDNA或全基因、终止子； 其中，PpGH61cDNA序列或全基因位于启动子的下游，终止子在PpGH61cDNA序列的下游。
[0035] 本发明的有益效果为：
[0036] 本发明在桧状青霉中克隆得到GH61糖苷酶编码基因，初步验证了GH61基因促使 纤维素水解。因此，通过在木质纤维素水解过程中在固有酶系里添加GH61蛋白，可以大大 提高酶解效率，降低酶用量，进而降低生产成本。