单个b细胞培养方法
【专利说明】单个B细胞培养方法
[0001] 本申请为2011年5月26日提交的、发明名称为"单个B细胞培养方法"的PCT申 请PCT/EP2011/058616的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2012年11 月28日，申请号为201180026559. 6。
[0002] 本文报导了得到由单个B细胞分泌的单克隆抗体的至少可变结构域的氨基酸序 列的方法，所述单个B细胞是通过单细胞沉积和在饲养混合物存在下与饲养细胞共培养从 来自实验动物的B细胞群中得到的。
[0003] 发明背景
[0004] 为了得到分泌单克隆抗体的细胞，广泛使用Koehler和Milstein开发的杂交瘤技 术。但是在杂交瘤技术中，只能融合和增殖从经免疫的实验动物中得到的B细胞的一部分。 B细胞的来源通常是经免疫的实验动物的器官，例如脾。
[0005] Zubler等人从1984年开始开发不同的方法用于得到分泌单克隆抗体的细胞（见 例如Eur.J.Immunol. 14 (1984) 357-63,J.Exp.Med. 160 (1984) 1170-1183)。其中从经免疫的 实验动物的血液中得到B细胞，并在包含细胞因子的饲养混合物的存在下与鼠EL-4B5饲 养细胞共培养。使用此方法，在共培养10-12天后可得到多达50ng/ml的抗体。
[0006]Weitkamp,J-H.，等人，（J.Immunol.Meth. 275(2003)223-237)报导了 从用荧 光病毒样颗粒选择的单个抗原特异性B细胞中生成针对轮状病毒的重组人单克隆抗体。 在US2006/0051348中报导了生产针对多种同源抗原的多种分离的抗体的方法。在TO 2008/144763和W0 2008/045140中分别报导了针对IL-6的抗体及其用途，以及得到抗原特 异性B细胞的克隆群的培养方法。在US2007/0269868中报导了得到抗原特异性B细胞的 克隆群的培养方法。Masri等人（在Mol.Immunol. 44(2007)2101-2106中）报导了在大肠 杆菌（E.coli)中克隆和表达功能性Fab片段，所述片段从针对炭疽毒素的单个人淋巴细胞 中得到。在W0 2007/031550中报导了制备免疫球蛋白文库的方法。
[0007] 发明概沐
[0008] 本文报导了从具有特殊性质的B细胞群中分离B细胞的方法。首先，在实验动物第 一次免疫后4周内已经可以分离诱导的抗体生产细胞，并可测定抗体的结合特异性。其次， 可通过以下任一步骤提高抗体生产细胞的数量和/或质量（例如抗体生产/分泌能力）： i)预孵育步骤，和/或ii)离心步骤，和/或iii)淘选步骤。第三，可通过加入IL-21，或 IL-6,或SAC，或BAFF改善用于B细胞和饲养细胞共培养的饲养混合物。
[0009] 因此，在一个方面本文报导了选择B细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
[0010] a)任选地标记B细胞群的B细胞，
[0011] b)单独地共培养已沉积为单细胞的B细胞群的每个B细胞和饲养细胞，
[0012] c)选择在步骤b)中增殖并分泌抗体的B细胞。
[0013] 在一个方面，本文还报导了得到B细胞克隆的方法，所述方法包括以下步骤：
[0014] a)从实验动物中得到B细胞，
[0015] b)标记B细胞，
[0016] c)将标记的B细胞沉积为单细胞，
[0017] d)单独地共培养单细胞沉积的B细胞和饲养细胞，
[0018] e)选择在步骤d)中增殖并分泌抗体的B细胞并因此得到B细胞克隆。
[0019] 在另一个方面，本文报导了生产特异性结合靶抗原的抗体的方法，所述方法包括 以下步骤：
[0020] a)任选地用至少一种荧光染料标记B细胞群的细胞，
[0021] b)在饲养细胞和饲养混合物的存在下培养已在单独的容器中沉积为单细胞的B 细胞群的每个B细胞，以得到单独的B细胞克隆和培养物上清液，
[0022] c)选择生产特异性结合靶抗原的抗体的B细胞克隆，
[0023] d)培养含有编码特异性结合靶抗原的抗体的核酸的细胞，所述抗体由步骤c)中 选择的B细胞克隆生产，或为其人源化变体，并从细胞或培养物上清液中回收抗体，从而生 产抗体。
[0024] 在一个实施方案中，所述方法包括一个或多个以下步骤：
[0025] 在步骤c)后：cl)通过逆转录酶PCR测定编码抗体的可变轻链结构域和可变重链 结构域的核酸序列，
[0026] 在步骤cl)后：c2)用包含编码抗体可变轻链结构域和可变重链结构域的核酸序 列的核酸转染细胞。
[0027] 在一个方面，本文还报导了生产抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
[0028] a)提供（成熟的）B细胞群（从实验动物的血液中得到），
[0029] b)用至少一种荧光染料（在一个实施方案中用1至3种，或2至3种荧光染料） 标记B细胞群的细胞，
[0030] c)在单独的容器中沉积经标记的B细胞群的单个细胞（在一个实施方案中，容器 是多孔板的孔），
[0031] d)在饲养细胞和饲养混合物的存在下培养沉积的各个B细胞（在一个实施方案 中，饲养细胞是EL-4B5细胞，在一个实施方案中，饲养混合物是天然TSN，在一个实施方案 中，饲养混合物是合成的饲养混合物），
[0032] e)测定在各个B细胞的培养基中分泌的抗体的结合特异性，
[0033] f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序来测定特异性结合抗体的可变轻和重链结构 域的氨基酸序列，并从而得到单克隆抗体可变轻和重链结构域的编码核酸，
[0034] g)为了表达抗体，将单克隆抗体可变轻和重链可变结构域编码核酸引入表达盒，
[0035] h)将核酸引入细胞，
[0036] i)培养细胞并从细胞或细胞培养物上清液中回收抗体，并从而生产抗体。
[0037] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述方法包括在单细胞沉积以前，在 共培养培养基中孵育B细胞群的步骤。在一个实施方案中，在约37°C进行孵育。在一个实 施方案中，孵育进行0.5至2小时。在特定的实施方案中，孵育进行约1小时。在一个实施 方案中，在约37°C进行孵育约1小时。
[0038] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述方法包括在共培养以前离心单细 胞沉积的B细胞的步骤。在一个实施方案中，离心进行约1分钟至约30分钟。在特定的实 施方案中，离心进行约5分钟。在一个实施方案中，以约100xg至约l，000xg进行离心。 在特定的实施方案中，以约300xg进行离心。在一个实施方案中，以约300xg离心约5分 钟。
[0039] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述方法包括紧接标记步骤以前的以 下步骤：用固定的抗原淘选B细胞。
[0040] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，通过密度梯度离心从动物血液中得到 B细胞群。
[0041] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，在免疫后4天从实验动物血液中得到 B细胞群。在另一个实施方案中，从在免疫后从4天到至少9天的实验动物血液中得到B细 胞群。在进一步的实施方案中，从在免疫后从4天到9天的实验动物血液中得到B细胞群。
[0042] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，通过密度梯度离心分离B细胞群。
[0043] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞是成熟的B细胞。
[0044] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，用1至3种荧光染料进行标记。在特 定的实施方案中，用2至3种荧光染料进行标记。
[0045] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞的标记导致总B细胞群的0. 1% 至2. 5%的细胞的标记。
[0046] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞是小鼠B细胞，或仓鼠B细胞， 或兔B细胞。
[0047] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，在多孔板的孔中进行单细胞沉积。
[0048] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，饲养细胞是鼠EL-4B5细胞。
[0049] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
[0050] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，标记是IgG+⑶19+_B细胞，IgG+⑶38+_B 细胞，IgG+CD268+-B细胞，IgGCD138+-B细胞，CD27+CD138+-B细胞，或CD3CD27+-B细胞。
[0051] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述B细胞是小鼠来源的，且标记是 IgG+CD19+-B细胞，和 / 或IgGCD138+-B细胞。
[0052] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述B细胞是仓鼠来源的，且标记是 IgG+IgM-B细胞。
[0053] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述B细胞是兔来源的，且标记是 IgG+_B细胞和/或CD138+-B细胞，或CD138+IgG+-B细胞和/或IgG+IgM-B细胞。
[0054] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，所述共培养是在补充了 10% (v/v) FCS，包含青霉素和链霉素的1% (w/v)的200mM谷氨酰胺溶液，2% (v/v)的100mM丙酮酸 钠溶液，和1%&八）的说2-(4-(2-羟乙基）-1-哌嗪）-乙烷磺酸〇^?￡3)缓冲液的1?^1 1640培养基中。在另一个实施方案中，所述共培养培养基还包含0. 05mMf3-巯基乙醇。
[0055] 在本文报导的所有方面的一个实施方案中，B细胞与饲养细胞和饲养混合物共培 养。在一个实施方案中，所述饲养混合物是天然的胸腺细胞培养物上清液（TSN)或合成的 饲养混合物。
[0056] 在一个特定的实施方案中，所述饲养混合物是合成的饲养混合物。在一个实施方 案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-10和肿瘤坏死因子a。在一个实施方案中，所 述合成的饲养混合物包含白介素-2 (IL-2)和/或白介素-10 (IL-10)。在一个实施方案中， 所述合成的饲养混合物还包含金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)Cowans菌株细胞 (SAC)。在一个实施方案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-21 (IL-21)。在一个实施方 案中，所述合成的饲养混合物包含肿瘤坏死因子家族的B细胞活化因子（BAFF)。在一个实 施方案中，所述合成的饲养混合物包含白介素-6 (IL-6)。在一个实施方案中，所述合成的饲 养混合物包含白介素(IL-4)。
[0057] 在一个实施方案中，在存在胸腺细胞培养物上清液作为饲养混合物时进行共培 养。在特定的实施方案中，从年轻动物胸腺的胸腺细胞中得到胸腺细胞培养物上清液。
[0058] 在一个实施方案中，得到B细胞克隆的方法还包括以下步骤：
[0059] f)通过逆转录酶PCR和核苷酸测序测定由步骤e)的选择的B细胞克隆生产的抗 体的可变轻和重链结构域的氨基酸序列，并从而得到单克隆抗体氨基酸可变结构域序列。
[0060] 在一个实施方案中，所述实验动物选自小鼠、仓鼠和兔。
[0061] 发明详沐
[0062] 本文报导的方法允许快速表征从单独的B细胞克隆得到的单克隆抗体的结合特 异性，即在实验动物的第一次免疫4周内可分离诱导的抗体生产细胞，并可测定从其生产 的抗体的结合特异性，其中根据B细胞共培养物上清液中的抗体量/浓度可进行至少4种 不同的实验。
[0063]免痔：
[0064] 通常使用非人动物，例如小鼠、兔、仓鼠和大鼠作为评估基于抗体的疗法的动物模 型。因此，经常需要提供结合非人动物抗原以及人抗原的交叉反应性抗体。本文报导的方 法可用于提供交叉反应性抗体。在本文报导的方法中，可使用从例如小鼠、仓鼠和兔中得 到的B细胞。在一个实施方案中，小鼠是NMRI-小鼠或balb/c-小鼠。在另一个实施方案 中，仓鼠选自亚美尼亚仓鼠（灰仓鼠（Cricetulusmigratorius))、中国仓鼠（黑线仓鼠 (Cricetulusgriseus))和叙利亚仓鼠（金黄仓鼠（Mesocricetulusauratus))。在特定的 实施方案中，仓鼠是亚美尼亚仓鼠。在一个实施方案中，兔选自新西兰白（NZW)兔、齐默尔 曼兔（ZIKA)、Alicia突变株兔、basilea突变株兔、具有人免疫球蛋白基因座的转基因兔、 rblgM敲除兔，及其杂种。
[0065] 在一个实施方案中，选择进行免疫的实验动物，例如小鼠、仓鼠和兔不大于12周。
[0066] B细胞的来源和分离：
[0067] 实验动物的血液提供了高多样性的抗体生产B细胞。从中得到的B细胞分泌的抗 体在CDR内几乎不具有相同或重叠的氨基酸序列，因此显示了高多样性。
[0068] 在一个实施方案中，得到从免疫后4天直到免疫或最近的加