氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株用于重组产生多肽的用图
【专利说明】氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株用于重组产生多化的用 途
[0001] 本发明是重组多肤产生的领域。本文更精确地报道了使用营养缺陷型恢复的原核 菌株在化学成分明确的基础生长培养基中重组产生非糖基化多肤的方法。
[0002] 发巧背景
[0003] 近年来，治疗性多肤的生产稳步增加并且很可能的是在不久的将来治疗性多肤将 成为可用于治疗多种疾病的最大治疗组。治疗性多肤的影响来自其特异性，如特定的祀标 识别和/或结合功能。
[0004] 细胞培养用于发酵过程中W产生物质，特别是多肤。在其中细胞培养物未被遗传 修饰并且形成其自身的代谢产物的过程与其中生物W它们产生更大量的其自身物质如多 肤或产生外源物质的运种方式被遗传修饰的过程之间进行区分。利用保证生物存活并使得 能够产生想要的祀标化合物的营养培养基供应产生物质的生物。许多培养基因使得能够最 优培养特定宿主的运些目的而闻名。
[0005] 化学成分明确的基础生长培养基在培养重组细胞中用于重组产生治疗性多肤中 的使用是有利的。其使得能够为所产生的治疗性多肤容易地开发下游加工和纯化，由于最 小化的原材料差异提供最稳健的生产过程并降低产品成本。
[0006] 化学成分明确的基础生长培养基不包含游离氨基酸，并且其需要使用原养型的细 胞系，其具有完整的代谢途径W从化学成分明确的基础生长培养基的可用成分产生所需的 氨基酸。
[0007] 例如，当大肠杆菌巧.coli)用作宿主细胞系时，一般使用野生型菌株，如MG1655、 W3110或化21。运些菌株显示良好的生长特性，但是较次等的产品效价。
[0008] 当与野生型菌株相比时，通过非定点诱变和选择已获得的突变体原核菌株在其基 因组DNA中显示明显差异。已经基于可W获得的最大产物效价选择了突变株。因为突变株 携带许多营养缺陷型，所W它们不能用于在化学成分明确的基础生长培养基中培养。突变 株需要氨基酸的补料W补偿其营养缺陷型，导致增加的培养成本。
[0009] US5, 932, 439报道了大肠杆菌巧scherichiacoli)K-12菌株用于产生重组蛋白 质。
[0010] 发巧概沐
[0011] 通过恢复营养缺陷型原核菌株其一种或多种营养缺陷型，所述营养缺陷型恢复的 菌株可W在化学成分明确的基础生长培养基上生长，其中不再需要向所述化学成分明确的 基础生长培养基中加入对应于已经恢复的营养缺陷型的物质。在昂贵物质的情况下，可W 实现产品成本的降低并且可W更经济地产生重组多肤。
[0012] 除了在缺少对应于已经恢复的营养缺陷型的物质的情况下恢复在化学成分明确 的基础生长培养基上生长的能力外，已经发现与未恢复的菌株相比，可W维持或甚至增加 可获得的产物效价。此外已经发现使用营养缺陷型恢复的原核菌株可获得的产物效价高于 利用对应的原养型野生型菌株可获得的产物效价。
[0013] 不希望受该理论束缚，当与对应的原养型野生型菌株（其中未曾进行该缺失和恢 复）相比时，假定本文报道的氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株具有不同的代谢和代谢 流。因此，原核菌株内某些酶的失活和再激活对菌株的完整代谢具有可检测的/显著的影 响，其例如可W在与对应的原养型野生型菌株相比该菌株的增加的生产力中看到。
[0014] 本文报道的一个方面是氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株，其特征在于
[0015] -已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，和
[0016] -菌株可W在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础 生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核菌株中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
[0017] 在一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核菌株是营养缺陷型恢复的大肠杆菌菌 株。
[0018] 本文报道的一个方面是氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株，其特征在于
[0019] -已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的至少一种缺陷，和
[0020] -细胞可W在化学成分明确的基础生长培养基中生长，所述化学成分明确的基础 生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
[0021] 在一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核细胞是营养缺陷型恢复的大肠杆菌细 胞。
[0022] 本文报道的营养缺陷型恢复的原核菌株/细胞可W用于重组产生治疗性多肤的 方法中，其中与非营养缺陷型恢复的原核菌株/细胞相比，不需要补充至少一种氨基酸残 基。
[0023] 本文报道的一个方面是用于在（重组）原核细胞中产生多肤的方法，其包括W下 步骤：
[0024] -在化学成分明确的基础生长培养基中培养（重组）原核细胞从原核细胞或原核 细胞的细胞周质或从培养基中回收多肤，所述（重组）原核细胞已经通过将恢复亲本原核 细胞的氨基酸营养缺陷型的核酸引入到亲本原核细胞的基因组中而被获得，所述（重组） 原核细胞包含编码多肤的一种或多种核酸。
[00巧]本文报道的一个方面是用于在（重组）原核细胞中产生多肤的方法，其包括W下 步骤：
[0026] -恢复对至少一种氨基酸营养缺陷的原核细胞的至少一种氨基酸营养缺陷型，
[0027] -在化学成分明确的基础生长培养基中培养氨基酸营养缺陷型恢复的（重组）原 核细胞，，并从原核细胞或原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肤，所述（重组）原核 细胞包含编码多肤的一种或多种核酸。
[0028] 本文报道的一个方面是用于在（重组）原核细胞中产生多肤的方法，其包括W下 步骤：
[0029] -在化学成分明确的基础生长培养基中培养（重组）原核细胞，其包含编码多肤的 一种或多种核酸，并从原核细胞或原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肤，
[0030] 其中所述（重组）原核细胞是氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞。
[0031] 在用于产生多肤的所有方法的一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核细胞具有 至少一种其他（未恢复的）氨基酸营养缺陷型。该营养缺陷型可W用于在引入编码目的多 肤（所述多肤）的一种或多种核酸后选择重组体/转化体。
[0032] 在用于产生多肤的所有方法的一个实施方案中，相比于在相同培养条件下和相同 生长培养基中未恢复的原核细胞（亲本细胞），氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞的生长 需要向生长培养基中补充较少的氨基酸。
[0033] 在用于产生多肤的所有方法的一个实施方案中，所述化学成分明确的基础生长培 养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
[0034] 在用于产生多肤的所有方法的一个实施方案中，相比于非营养缺陷型恢复的原核 细胞（亲本/亲本细胞）的培养所需，营养缺陷型恢复的原核细胞的培养需要向生长培养 基中补充较少的一种或两种或=种或四种氨基酸。
[0035] 在用于产生多肤的所有方法的一个实施方案中，在培养过程中不添加对应于已经 在营养缺陷型恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
[0036] 在用于产生多肤的所有方法的一个实施方案中，在缺少对应于已经在营养缺陷型 恢复的原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸的情况下进行培养。
[0037] 在用于产生多肤的所有方法的一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌细胞。
[0038] 在用于产生多肤的所有方法的一个实施方案中，多肤是全长抗体链、单链抗体、单 结构域抗体、scFv、scF油、或上述之一与非抗体多肤的缀合物。
[0039] 在用于产生多肤的所有方法的一个实施方案中，多肤是scFv或scF油与细胞毒性 剂的缀合物。
[0040] 本文报道的一个方面是氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株用于（重组）产生多肤 的用途。
[0041] 在一个实施方案中，
[0042] -在氨基酸营养缺陷型恢复的原核菌株中，已经恢复了必需氨基酸代谢途径中的 至少一种缺陷，和
[0043] -氨基酸营养缺陷型恢复的菌株可W在化学成分明确的基础生长培养基中生长， 所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的原核菌株中恢 复的营养缺陷型的氨基酸。
[0044] 在一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核菌株是营养缺陷型恢复的大肠杆菌菌 株。
[0045] 在一个实施方案中，多肤是全长抗体链、单链抗体、单结构域抗体、scFv、scF油、或 上述之一与非抗体多肤的缀合物。
[0046] 在一个实施方案中，多肤是scFv或scF油与细胞毒性剂的缀合物。
[0047] 在所有方面的一个实施方案中，营养缺陷型恢复的原核菌株是非溶源性菌株。溶 源性菌株被暂时性隧菌体感染，即非溶源性菌株没有隧菌体。
[0048] 在所有方面的一个实施方案中，恢复是定向恢复，其仅祀向氨基酸营养缺陷型。
[0049] 在所有方面的一个实施方案中，恢复是引入合成营养缺陷型氨基酸所需的一种或 多种酶。
[0050] 在所有方面的一个实施方案中，原核菌株具有基因型thi-1、AompT、ApyrF。
[00引]发巧详沐
[0052] 开发大规模重组多肤产生方法的一个目标是在培养过程中降低培养基组分的需 求量，即消耗。尤其是降低昂贵的培养基组分，如氨基酸的消耗在产品成本方面是有利的。
[0053] 已经通过恢复氨基酸营养缺陷型菌株其至少一种、一些或所有的氨基酸营养缺陷 型完成了该目标，w避免补料昂贵的氨基酸，于是降低重组产生目的多肤的成本。此外，可W使用化学成分明确的培养基，其导致提高的方法稳定性并促进下游加工值SP)。
[0054] 因此，本文报道的是在化学成分明确的基础生长培养基中使用营养缺陷型恢复的 原核菌株重组产生非糖基化多肤的方法。
[00巧]已经发现通过恢复营养缺陷型原核菌株其一种或多种营养缺陷型，所述营养缺陷 型恢复的菌株可W在化学成分明确的基础生长培养基中生长，不再需要向所述化学成分明 确的基础生长培养基中添加对应于已经恢复的营养缺陷型的物质。在昂贵物质，如例如氨 基酸的情况下，可W实现产品成本的降低并且可W更经济地产生重组多肤。
[0056] 除了在缺少对应于已经恢复的营养缺陷型的物质的情况下恢复在化学成分明确 的基础生长培养基上生长的能力外，已经发现可W维持或甚至增加可获得的产物效价。此 外已经发现，使用营养缺陷型恢复的原核菌株的可获得产物效价高于利用对应的原养型野 生型菌株可获得的产物效价。
[0057] 本文报道的一个方面是用于在原核细胞中产生多肤的方法，其包括W下步骤：
[0058] -在化学成分明确的基础生长培养基中培养原核细胞，并从所述原核细胞或所述 原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肤，所述原核细胞已经通过将恢复亲本原核细胞 的氨基酸营养缺陷型的核酸引入到亲本原核细胞的基因组内获得，其包含编码多肤的一种 或多种核酸。
[0059] 本文报道的一个方面是用于在原核细胞中产生多肤的方法，其包括W下步骤：
[0060] -恢复对至少一种氨基酸营养缺陷的原核细胞的至少一种氨基酸营养缺陷型，
[0061] -在化学成分明确的基础生长培养基中培养氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞， 并从所述原核细胞或所述原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肤，所述原核包含编码 多肤的一种或多种核酸。
[0062] 本文报道的一个方面是用于在（重组）原核细胞中产生多肤的方法，其包括W下 步骤：
[0063] -在化学成分明确的基础生长培养基中培养（重组）原核细胞，并从所述原核细胞 或所述原核细胞的细胞周质或从培养基中回收多肤，所述（重组）原核细胞包含编码多肤 的一种或多种核酸，
[0064] 其中所述（重组）原核细胞是氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞，
[0065] 其中相比于在相同培养条件下和相同生长培养基中未恢复的原核细胞（亲本细 胞），氨基酸营养缺陷型恢复的原核细胞的生长需要向生长培养基中补充较少的氨基酸，并 且
[0066] 其中所述化学成分明确的基础生长培养基不含对应于已经在营养缺陷型恢复的 原核细胞中恢复的营养缺陷型的氨基酸。
[0067] "氨基酸营养缺陷型原核细胞"是运样的原核细胞，其不能合成必需氨基酸，例如 由于包含编码对应的生物合成途径的蛋白质的结构基因的基因座内的突变或缺失。不向培 养基中添加各氨基酸，细胞则不增殖。营养缺陷型可W是对任何氨基酸的。原核细胞也可 W是对多于一种氨基酸营养缺陷。因此，在一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是 对至少两种氨基酸营养缺陷。在另一实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是对至少两 种、至少=种、至少四种、至少五种氨基酸营养缺陷。在其他实施方案中，氨基酸营养缺陷型 原核细胞是对至少2种至高达5种、或高达10种、或高达15种氨基酸营养缺陷。在另一实 施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是对两种至五种氨基酸、或两种至=种氨基酸、或对 两种氨基酸、或对=种氨基酸、或对四种氨基酸营养缺陷。在一个实施方案中，（氨基酸）营 养缺陷型恢复的细胞具有至少一种氨基酸营养缺陷型、或至少两种氨基酸营养缺陷型、或 至少=种氨基酸营养缺陷型、或一种至=种氨基酸营养缺陷型、或两种氨基酸营养缺陷型。
[0068] 在一个实施方案中，氨基酸营养缺陷型原核细胞是细菌细胞。
[0069] 在一个实施方案中，细胞是大肠杆菌属（Escherichia)细胞，或芽抱杆菌属 度acillus)细胞，或乳杆菌属（Xactobacillus)细胞，或棒状杆菌属（Corynebacterium) 细胞，或酵母细胞（酵母属（Saccharomyces)、假丝酵母属（Candida)或毕赤酵母 属（Pichia))。在其他实施方案中，细胞是大肠杆菌细胞，或枯草芽胞杆菌度acillus subtilis)细胞，或嗜酸乳杆菌（Xactobacillusacidophilus)细胞，或谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacteriumglutami州m)细胞，或己斯德毕赤酵母（Pichiapastoris)酵母细胞。
[0070] 可W用于本文报道的方法中的原核细胞可W包含一种或多种氨基酸营养缺陷型。 例如，在亮氨酸生物合成途径中缺陷的大肠杆菌细胞可W选自LeuB6缺陷的细胞13-6，
[0071] X148，X156，X2224，X462，X463，X474，X478，X515，X65，X697，X760， 2000kMSE248, 342-167, 342MG，679-680,A586,A592,A593,AA100,AA7852,AA787,AB1102， AB1111，AB1115,AB1122,AB1129,AB113,AB1132,AB1133,AB114,AB1157,AB1157-D， AB1314,AB1330,AB1331，AB1881，AB1884,AB1885,AB188,CP78,CP79,CR34Thy-，CR：M Thy-SR，CR34/308,CR34/313,CR34/399,CR：M/43,CR34/454,CR34/500,CR：M/7a，CS130， CS312,CS419,CS425,CS426,CS460,CS471，CS472,CS50,CS81，CS85,CSR06,CSR603,CSR603/ PDR1996,CT28-3b，DAIO,DAll，DB1161，DB1257,DE1878,DE1882,DE2：M5,DF225,DF41， JRG94，JS10C600r-m-，T6R，P678SSRpr〇-，PA20SR，PA200SR，PA201SR，PA214SRT6R，PA265 SR，PA309,PDE70,PA340,PA340/T6,PA360,PA414,PAM161，PAM162,PAM163,PAM164,PAM660， PAT84，PB：M9，PB69，PCI，PC2，PC3，PC5，PC6，PCS，PJ1，PJ2，PJ3，PJ4，P巧，PJC600 ( =CRSR)， W208SRAzR,W2660,LAM-,W945his,WA2127,WA2379,WA2548,WA2552,WA2574,WA2899, WA921，WA946,WA960,YIO,Y46,Y53,Y70,YYClOO。
[0072] 在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌K12细胞或大肠杆菌B细胞。
[0073] 术语"生长"指培养中活力细胞密度的改变。该改变可W是随时间的改变。可W 通过测定578nm处的光密度来测定活力细胞密度。
[0074] 在一个实施方案中，生长是时期内活力细胞密度的增加。在一个实施方案中，时期 是接种后培养的0-30小时的时期。
[00巧]术语"相同的"表示第二个值在第一个值的+/-20%之内。关于培养条件，术语"相 同的"指培养时间、培养体积、培养溫度、接种细胞密度、通气速率、pH值、揽拌器速度、补料 速度（如果可应用）等。关于培养基，术语"相同的"表示第二种培养基相比于第一种培养 基在至多5种组分上不同（不同=存在或缺失）。
[0076] 在一个实施方案中，相同的培养条件是同一的培养条件。在一个实施方案中，相 同的培养基是同一的培养基。
[0077] 用于培养原核细胞并也用于培养氨基酸营养缺陷型原核细胞的方法为本领域技 术人员所知（参见例如Riesenberg,D.,等，Qirr.Opin.Biotechnol. 2 (1991) 380-384)。
[0078] 可W利用任何方法