水稻基因ORYsa;LPR5的基因工程应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程技术领域，涉及水稻基因 ORYsa ;LPR5的基因工程应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国主要的粮食作物之一，我国水稻种植面积占全球谷类作物种植面积 的1/3,水稻产量占全国粮食总产的50%，是保证我国粮食安全的最重要作物（胡培松 等，2002)。
[0003] 磷是植物生长发育所必需的三大营养元素之一。它不仅涉及到生物膜及核酸 的合成，同时在能量代谢和酶的调控上扮演重要的角色。由于磷素（P043 -、HP042 -、 H2P04 -)在酸性与碱性土壤中的强烈固定作用，使得饱和的土壤溶液中可溶性磷的含量很 低（小于 10 U M) (Bieleski, R. L. Phosphate pools, phosphate transport and phosphate availability. Annu. Rev. Plant Physiol. 1973, 24, 225 -252)，远远满足不了植物的生长需 要，使其成为植物生长的一大限制性因子。因此植物能否高效利用土壤中少量的可溶性磷 对植物生长有着至关重要的影响。
[0004] 另外，植物体的生长过程分为营养生长和繁殖生长两个时期。营养生长时期，根系 吸收的氮、磷除了满足自身各种生命活动的需要，在液泡中积累形成库；繁殖生长时期，在 叶片、茎杆中积累的磷向繁殖器官转移，形成新的源和库（Marschner，1995)。磷元素在体内 的再分配受严格的时空调控，而且随着人们生活水平的提高，稻米的营养品质日益受到关 注。研究如何改良磷生长后期向籽粒中的转运与再分配对于改善稻米品质具有重要意义。
[0005] 在之前的研究中，拟南芥中的编码多铜氧化酶的基因 AtLPRl和它的同源基因 AtLPR2参与到缺磷条件下种子根发育及对环境中磷的感受机制。水稻作为单子叶模式植物 与双子叶模式植物拟南芥在根系发育，磷的响应机制都有许多不同。我们通过在多个基因 组数据库中的检索比对，确定了水稻中的5个LPR基因，OsLPRl - 5。本发明对其中的LPR5 进行了较详尽的研究，LPR5与拟南芥AtLPRl/AtLPR2氨基酸序列的一致性分别为45. 1% /44. 8%。虽然0sLPR5, AtLPRl/2都与植物磷素营养调控网络中发挥重要左右，但是两者在 功能上的区别是显而易见的。拟南芥中的AtLPRl/2导致影响了植株主根根系伸长，减少了 根系细胞间隙间铁的积累，缓解了拟南芥根系在缺磷情况下根系发育受阻的症状。水稻中， 我们过量表达了 0sLPR5基因，水稻主根和不定根的根长均变长。除了根系的变化之外，水 稻中过量表达0sLPR5还显著提高了根系对磷酸盐的吸收，植物体内磷的的积累。而LPR基 因表达量的变化影响植物对磷吸收、利用效率的提高在拟南芥的研究中并未涉及。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供水稻多铜氧化酶基因 ORYsa ;LPR5的基因工程应用，该基 因在水稻中超表达提高水稻磷素吸收利用和促进水稻根系发育。
[0007] 技术方案
[0008] 本发明提供了水稻多铜氧化酶基因 ORYsa ;LPR5的基因工程应用，其基因序列登 录号为0s01g0127200,基因序列全长3370bp，包括3个外显子和2个内含子。cDNA序列为 SEQ IDNO. 1，全长2485bp，其编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID N0.2,共637个氨基酸。以NCBI 网站获取的基因全序列转化水稻，使其超量表达。
[0009] 将获得的纯合体株系进行水培实验，测定苗期不同部位总磷浓度，水稻种子根和 不定根的长度等生理指标。
[0010] 将获得的纯合体株系进行盆栽实验，测定于成熟期分部位采样，测定各部位磷浓 度差异。采样部位包括：倒一叶、倒二叶、茎、穗杆、穗柄、瘪壳、种壳、种子。
[0011] 上述基因 ORYsa ;LPR5的基因工程应用，是指在提高水稻磷素吸收利用和促进水 稻根系发育。
[0012] 有益效果
[0013] 本发明基因 ORYsa ;LPR5的功能为单子叶植物中的首次报道，在提高土壤中磷素 吸收利用效率方面起着重要作用。ORYsa ;LPR5作为目的基因导入植物，其超量表达可提高 磷吸收总量近两倍，且提高了水稻根系对磷的吸收速率，提高植物耐低磷能力，促进水稻根 系发育作用，为培育适用于磷贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。
【附图说明】
[0014] 图1 :水稻基因 ORYsa ;LPR5在不同组织部位的表达模式。
[0015] 图2 :水稻基因 ORYsa ;LPR5在不同缺素条件，不同缺磷时间点的表达模式。
[0016] 图3 :0RYsa ;LPR5基因超量表达材料与野生型水稻（日本晴）表型差异及生物量 的统计。
[0017] 图4 :正常供磷/缺磷条件下，ORYsa ;LPR5基因超表达植株的根、茎、老叶和新叶 中的有效磷和总磷含量。
[0018] 其中，WT代表野生型水稻，Oxl - 4分别代表ORYsa ;LPR5超表达株系（图5 - 8 同）。
[0019] 图5 :正常供磷/缺磷条件下，ORYsa ;LPR5基因超表达植株根系P32吸收速率
[0020] 图6 :正常供磷/缺磷条件下，ORYsa ;LPR5基因超表达植株的根系表型
[0021] 图7 :正常供磷/缺磷条件下，ORYsa ;LPR5基因超表达植株的种子根和不定根长 度
[0022] 图8 :0RYsa ;LPR5基因超表达转基因材料在生长后期全磷含量。
[0023] 图9 pTCK303质粒图谱。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1、基因序列的获得
[0025] 申请人在NCBI网站（www. ncbi. nlm. nih. gov)上输入ORYsa ;LPR5得到基因序 列号为0s01g0127200的一段编码多铜氧化酶基因的DNA序列。分析表明该基因序列全长 3370bp，cDNA全长2485bp，开放阅读框ORF为1914bp，编码637个氨基酸。该基因有3个 外显子、2个内含子。
[0026] 实施例2、ORYsa ;LPR5基因的表达模式鉴定
[0027] 2. 1、总RNA的提取和转录合成cDNA第一链
[0028] 选用水稻品种"日本晴"，待水稻幼苗长至10天后，完全营养液培养1周后采样 (倒一叶，倒二叶，倒四叶，倒二叶叶鞘，倒四叶叶鞘，根茎结合部，根系根尖，根系伸长区和 成熟区）。水稻苗龄至30天移栽至盆砵中进行盆栽处理，苗龄60天时进行采样（旗叶，倒 三叶，旗叶叶鞘，倒三叶叶鞘，杆，茎结和穗柄）。分别采用TriZol试剂抽提总RNA，用琼脂 糖凝胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。以获得的总RNA为模版， 经过逆转录获得水稻cDNA第一链，供后续的实验使用。cDNA第一链的合成步骤：用DEPC 水处理过的 PCR 管（300 μ 1)，加入总 RNA 5 μ g，oligodT 1 μ L(25ng/ μ L)，dNTP(10mmoL/ L) 2 μ L，65 °C水浴5min，迅速置于冰上冷却，加5X反应缓冲液4 μ L，M - MLV逆转录酶 (200U/ μ L) 1 μ L，RNase抑制剂0. 5 μ L，DEPC水至总体积为20 μ L (以上均在冰上操作）。稍 离心后置于42°C水浴lh，70°C水浴lOmin，然后置于冰上迅速冷却。所得产物即为cDNAs， 置于-20°C保存。
[0029] 2. 20RYsa ;LPR5基因的组织特异性表达模式鉴定
[0030] 以步骤2. 1获得的"日本晴"cDNA为模板，根据水稻0sLPR5基因的编码序列，设计 以下OsLPR5基因特异引物Pl、P2扩增长度为301bp片段长度鉴定ORYsa ;0sLPR5基因的表 达模式。
[0031] Pl CGATGAGAATATGAGATGAAGAAGCT (SEQ ID NO. 3)
[0032] P2 CGCACCAGTTTATGACTAGCAAA (SEQ ID NO. 4)
[0033] PCR具体步骤为：以步骤1获得的cDNA为模板，使用ABI St印OnePlus (购自ABI 生物公司）和SYBR PremixExTaq Kit (购自TaKaRa公司）进行基因定量PCR分析。根据 TaKaRa试剂说明使用20 μ 1的反应体系：SYBR PremixExTaq 10 μ 1，上下游引物各0. 4 μ 1， cDNA 模板 2 μ 1，ROX Reference Dye (50χ) 0.4 μ l，ddH20 6.8 μ 1。反应条件为：40 个循环， 95°C lmin，95°C 5s，60°C 30s，95°C 15s，60°C lmin，95°C 5s。定量结果根据 2 - ACt 方法计 算分析鉴定0sLPR5基因的时空表达模式，结果见图1。委托南京金斯瑞生物技术公司测序 确定序列为ORYsa ;0sLPR5片段。
[0034] 由图1可以看出，ORYsa ;LPR5基因主要在根系和根茎结合部表达。
[0035] 2.