脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞及生物医药领域。具体地说，本发明涉及人源脂肪干细胞 (Human-Adipose Derived Stem Cell，hADSC)来源的运动神经兀样细胞（motoneuron-like cell，MNLC)及其制备方法和在预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤中的应用。
【背景技术】
[0002] 脊髓损伤（SCI)是伴有外伤水平相关的突然性功能丧失的一种破坏性状况，从而 导致瘫痪以及相关的并发症。最初的外伤后，会发生一系列次生事件级联反应，包括局部缺 血、细胞死亡、出血、炎症、水肿和进一步的组织损伤，从而在损伤部位导致脱髓鞘、轴突变 性和空穴现象。传统的治疗包括外科手术以使损伤减压并稳定，预防次生并发症以及促进 机能恢复。现也实施了各种新型治疗方法，例如给予针对髓磷脂相关神经突生长抑制剂的 抗体和神经营养因子。然而，所有这些策略对脊髓损伤仅有有限的疗效。相反，干细胞治疗 因它们自我更新、分化成多种谱系、分泌神经营养因子和抗炎性细胞因子的能力而对于脊 髓损伤修复有很大希望。为作SCI治疗，已在实验上和临床上检验了几种基于干细胞的策 略，包括ES细胞，间充质干细胞（MSC)，例如BM衍生的基质细胞（BMSC)和脂肪衍生的干细 胞（ADSC)，神经干细胞（NSC)和诱导的多潜能干细胞（iPSC)。虽然ESC在体外几乎可无限 增殖并且能分化成任何谱系，但它们因致瘤可能性和难以获得不具核型异常的高纯度的任 何单一谱系以及伦理担忧而在临床应用上极具争议。开发iPSC技术可极大克服利用ESC 而产生的伦理问题，然而，阻碍ESC应用的问题对于iPSC仍存在。在技术上，iPSC诱导的传 统方案需要病毒感染和易于致瘤的潜在基因组转基因整合。该缺陷可通过新的诱导技术， 例如腺病毒、幼猪Bac转座子、直接蛋白转导和纯粹的化学诱导来克服，然而，这些iPSC的 临床应用的安全性与有效性尚未被证明。
[0003] 与ESC/iPSC不同，基于MSC的干细胞疗法较少产生安全性和伦理问题的顾虑，因 此在研究人员之中越来越多普及。MSC是可从许多组织，例如骨髓、脐带血、骨骼肌和脂肪 组织分离的一组异质多能细胞。MSC有自我更新以及分化成入中胚层、外胚层和内胚层来源 的各种细胞的能力，例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和神经元等。MSC的主要优 点包括它们可自体移植，它们可以分泌一些神经营养因子和细胞因子来提高贫弱的细胞存 活并抑制炎症以便修复。用于SCI细胞替代疗法的最常见细胞是BMSC，但它们的效果有争 议，一些显示改善运动，而其它无此作用，可能是因为缺乏在体内和体外一致的将MSC转化 成神经细胞的方法。虽然MSC有治疗益处，但这些细胞也存在不应忽略的不利作用，特别是 促进肿瘤形成、生长和转移的潜能。还有报道说长期体外扩增或遗传操作导致MSC经历恶 性转化。因此，MSC的临床应用还需仔细思量。
[0004] 在各种MSC中，发现ADSC与BMSC及其类似，免疫原性低，还具有免疫抑制性，但易 于收获和体外扩增，因此它们的治疗潜能收到越来越多的关注。可对ADSC作预先程序化处 理以使之向神经谱系分化，可在神经元分化前作有丝分裂刺激，通过关键NES增强子元件 的脱甲基化增强该预先程序化处理。因此，许多研究证实ADSC具有较强的分化能力。ADSC 还能形成其它神经细胞，例如少突胶质细胞和功能性Schwann细胞。由于这些优点，ADSC更 被视为SCI治疗的理想干细胞来源。由于运动神经元丧失是SCI患者中永久性残疾的主要 原因之一，预计运动神经元替代可带来一定的功能恢复。当将衍生自小鼠或人ESC的运动 神经元移植入SCI动物模型，它们存活并整合入受损的组织，还观察到显著的运动功能改 善。最近，两个研究组独立报道改进了将ESC/iPSC转化成运动神经元的方案，利用该改进 方案他们能将hADSC诱导成运动神经元样细胞，但获得的运动神经元样细胞的成熟度低、 存活时间短。然而，本领域技术人员知晓分化诱导得到的细胞离真正用于临床治疗还有相 当长的距离，很多分化诱导得到的细胞，即使是高度成熟的分化细胞也可能因为种种原因 而最终未能应用于临床治疗。因此，分化诱导得到的运动神经元样细胞在相关SCI模型中 疗效还有待解决。
[0005] 因此，本领域急需开发能够将hADSC有效转分化成运动神经元样细胞，并且对SCI 具有真正治疗潜能的方法并提供相应的细胞。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种将脂肪干细胞分化成运动神经元样细胞的方法。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种成熟度高的脂肪干细胞来源的运动神经元样细 胞群。
[0008] 本发明还有另一目的在于提供一种具备优异治疗潜能的脂肪干细胞来源的运动 神经元样细胞群。
[0009] 在第一方面，本发明提供一种将脂肪干细胞分化成运动神经元样细胞的方法，所 述方法包括以下步骤：
[0010] 利用运动神经元样细胞诱导剂处理3-6代脂肪干细胞6-84小时，从而获得运动神 经元样细胞群。
[0011] 在优选的实施方式中，利用运动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞6-72小时。
[0012] 在优选的实施方式中，所述脂肪干细胞是3-5代，更优选3代。
[0013] 在另一优选的实施方式中，所述脂肪干细胞是高纯度脂肪干细胞，其中75%以上， 优选85%以上的脂肪干细胞是⑶29、⑶44、⑶105阳性细胞；而10%以下，优选3. 5%以下的 脂肪干细胞是⑶45和⑶133阳性细胞。
[0014] 在另一优选的实施方式中，利用运动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞18-30 小时，更优选24小时。
[0015] 在另一优选的实施方式中，在利用运动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞后， 利用神经营养因子继续处理60-84小时，优选66-78小时。
[0016] 在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞诱导剂是Sonic Hedgehog途径激活 剂和视黄酸，更优选地，所述运动神经元样细胞诱导剂是Purmorphamine或SHH或Hh-AgL 5 和视黄酸，更优选地，所述运动神经元样细胞诱导剂是SHH和视黄酸。
[0017] 在优选的实施方式中，所述神经营养因子是选自下组：BDNF、NGF、NT3、CNTF、OTNF 或 IGF。
[0018] 在进一步优选的实施方式中，所述神经营养因子是BDNF、⑶NF或IGF。
[0019] 在优选的实施方式中，所述脂肪干细胞是人源脂肪干细胞，优选纯度较高的人源 脂肪干细胞。
[0020] 在优选的实施方式中，所述方法得到的运动神经元样细胞群具有选自下组的任一 或多种特征：
[0021] (1)有50%以下，优选40%以下，最优选30%以下的细胞表达运动神经元祖细胞标 志物；
[0022] (2)有70%以上，优选80%以上，最优选85%以上的细胞表达运动神经元标志物；
[0023] (3)有70%以上，优选80%以上，最优选90%以上的细胞表达神经元标志物；
[0024] (4)有30%以上，优选40%以上，最优选45%以上的细胞可观察到复杂的突触结构；
[0025] (5)有30%以上，优选40%以上，最优选50%以上的细胞表达突触蛋白；和
[0026] (6)有60%以上，优选70%以上，最优选80%以上的细胞表达离子通道蛋白，从而具 备电生理特性。
[0027] 在优选的实施方式中，所述方法得到的运动神经元样细胞的分化效率是80-90%， 优选85~95%，体外存活时间是30-35天。
[0028] 在优选的实施方式中，所述方法得到的运动神经元样细胞在移植后8周，没有检 测到肿瘤形成。
[0029] 在第二方面，本发明提供一种脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞群，所述细胞 群具有以下一种或多种特征：
[0030] (1)有50%以下，优选40%以下，最优选30%以下的细胞表达运动神经元祖细胞标 志物；
[0031] (2)有70%以上，优选80%以上，最优选85%以上的细胞表达运动神经元标志物；
[0032] (3)有70%以上，优选80%以上，最优选90%以上的细胞表达神经元标志物；
[0033] (4)有30%以上，优选40%以上，最优选45%以上的细胞可观察到复杂的突触结构；
[0034] (5)有30%以上，优选40%以上，最优选50%以上的细胞表达突触蛋白；和
[0035] (6)有60%以上，优选70%以上，最优选80%以上的细胞表达离子通道蛋白，从而具 备电生理特性。
[0036] 在优选的实施方式中，有70%以上，优选80%以上，最优选85%以上的细胞还表达 神经元间标志物，例如GAP43和神经胶质标志物，例如GFAP。
[0037] 在优选的实施方式中，所述运动神经元祖细胞标志物选自：01ig〇2、PAX6。
[0038] 在优选的实施方式中，所述运动神经元标志物选自：HB9、Sim-1、01igo2、ChAT、 Nkx6.1。
[0039] 在优选的实施方式中，所述神经细胞标志物选自：Synapsinl/2、MAP2、Tujl、NFL、 NFM、GAP43、GFAP、NF-200。
[0040] 在优选的实施方式中，所述突触蛋白选自：SNAP25、Synapsinl/2。
[0041] 在优选的实施方式中，所述离子通道蛋白选自：电压依赖性钠通道、钙通道、钾通 道。
[0042] 在优选的实施方式中，有70%以上，优选75%以上，最优选80%以上的细胞不表达 运动神经元祖细胞标志物，例如01ig〇2和PAX6。
[0043] 在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群的分化效率是80-90%，优选 85-95%，体外存活时间是30-35天。
[0044] 在第三方面，本发明提供一种脂肪干细胞来源的运动神经元样细胞群，所述细胞 群具有以下一种或多种特征：
[0045] (1)有50%_70%的细胞表达运动神经元祖细胞标志物01igo2 ;
[0046] (2)有30%_50%的细胞表达运动神经元祖细胞标志物PAX6 ;
[0047] (3)有60%_80%的细胞表达运动神经元标志物HB9 ;
[0048] (4)有70%_90%的细胞表达神经元标志物MAP2 ;
[0049] (5)有20%_40%的细胞表达神经元标志物Synapsinl/2 ;
[0050] (6)有20%-40%的细胞不表达HB9 ;
[0051] ⑵有 6〇%_8〇% 的细胞不表达 Synapsinl/2 ;
[0052] (8)有10%-30%的细胞不表达MAP2。
[0053] 在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群中的细胞不表达ChAT、观察不到 复杂的突触结构、不表达离子通道蛋白。
[0054] 在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群中的细胞有继续分化成本发明第 二方面所述细胞群的潜能。
[0055] 在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群采用本发明的上述方法制备，其 中，利用运动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞18-30小时，更优选24小时。
[0056] 在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群用于制备本发明第二方面所述的 运动神经元样细胞群。
[0057] 在另一优选的实施方式中，所述细胞群采用本发明第一方面所述的方法制备。
[0058] 在优选的实施方式中，所述细胞群采用本发明的上述方法制备，其中，在利用运 动神经元样细胞诱导剂处理脂肪干细胞后，利用神经营养因子继续处理60-84小时，优选 66-78小时。
[0059] 在优选的实施方式中，所述脂肪干细胞是人源脂肪干细胞。
[0060] 在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群在移植后8周，没有检测到肿瘤 形成。
[0061] 在第四方面，本发明提供本发明第二和第三方面所述运动神经元样细胞群的用 途，所述运动神经元样细胞群用于制备预防或治疗运动神经元损伤和脊髓损伤的药物。
[0062] 在优选的实施方式中，所述运动神经元损伤包括：肌萎缩侧索硬化症 (ALS, Amyotrophic lateral sclerosis)、路格瑞氏症（Lou Gehrig's disease)、进行性延 髓麻痹、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症（SM, Spinal Muscular Atrophy)。
[0063] 在优选的实施方式中，所述运动神经元样细胞群是本发明第三方面所述的运动神 经元样细胞群。
[0064] 在第五方面，本发明提供一种药物组合物，