一种人脐带间充质干细胞规模化制备的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人脐带间充质干细胞规模化制备的方法。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)作为一种成体干细胞广泛分布在于全身多种组织中，可在体外大量培养扩增，并在特定条件下向内、中、外三个胚层来源的细胞分化。MSC是继胚胎干细胞和造血干细胞之后的又一科研热点，已成为二十一世纪治疗多种系统疾病的实用性干细胞。它在免疫调节及组织修复中具有潜在的临床应用价值，近年来已逐步应用于系统性红斑狼疮、骨和肌肉衰退性疾病、心脑血管疾病、肝病、脑及骨髓神经损伤、老年痴呆等疾病的治疗。
[0003]间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是以干细胞治疗为基础的全新生物制品。目前国内尚无此类产品上市，国外率先开发该类产品的是美国Osiris公司，其产品(商品名=Prochymar)已于2012年先后获得加拿大和新西南政府批准上市。Prochymal?是来源于人骨髓的异体间充质干细胞(Human Bone Marrow MesenchymalStem Cells，hBM_MSC)，用于治疗造血干细胞移植中所产生的移植物抗宿主病(Graftvs.Host Disease，GvHD)，其主要功能之一为免疫调节作用。除此之外，Prochymal?还于2008年首先用于治疗I型糖尿病的II期临床研究。另外，韩国也有类似的产品(商品名:Heaticellgram-ΑΜΓ)于2011年在韩国上市，该产品为自体骨髓间充质干细胞制剂，适应症为急性心肌梗死；以色列Pluristem公司的在研产品(商品名:PluriPacf)于2011年在美国获得FDA临床研究批准，用于糖尿病造成的肢体末端组织坏死的修复治疗，其成分为人胎盘/脐带间充质干细胞。此外，FDA批准的有关MSC细胞治疗的临床方案还包括:①MSC静脉输注治疗Crohn病MSC局部应用治疗牙周疾病MSC静脉输注治疗心肌梗死；④MSC修复本月板及⑤G-CSF动员的骨髓MSC治疗心肌梗塞等。国内的临床研究中MSC适应症的选择较为广泛，拟用于预防或治疗GvHD、心肌梗死、骨缺损、糖尿病足坏死、肝脏损伤或股骨头坏死等。
[0004]MSC的组织来源广泛，如骨髓、脂肪、脐带。其中脐带是连于胚胎脐部与胎盘间索状结构，其中富含造血、间充质、神经及内皮等多种干/祖细胞。与骨髓来源的MSC相比较，人脐带来源间充质干细胞的优势在于:收集过程相对简单、无创、胎盘屏障使脐带受病毒与细菌污染少、脐血免疫系统的原始性降低了移植后受体发生排斥反应的机率，在体外培养体系中能快速增值，传代后3-5天能增值4-5倍，传代培养10代以上细胞可增加5-10倍，且增速速度无明显降低，传代稳定。此外，人脐带间充质干细胞不存在伦理学问题、较强的归巢能力和易于基因转染等优点使其成为实施细胞治疗的理想细胞，并在肿瘤的靶向治疗、组织工程和组织修复方面具有骨髓来源的间充质干细胞和其他成体干细胞无可比拟的优越性。
[0005]MSC在细胞治疗、基因治疗以及组织工程中的应用前提是MSC规模化、规范化培养。为了实现规模化、产业化，达到精密控制生产过程、降低生产成本、便于下游工作及提高生物制品的质量以及安全性，使得不断优化细胞培养技术、优化和选择适宜的细胞培养工艺显得尤为重要。因此建立人脐带间充质干细胞简便、高效、安全的培养工艺十分必要。
[0006]但传统培养工艺制备的hUC-MSC往往存在诸多问题，因为制备过程中需要引入多种外源物质。因此带来的各种残留问题限制了 hUC-MSC临床应用产品的开发，如牛血清、抗生素、胰酶等，其中牛血清残留问题最具代表性。
[0007]传统的MSC培养液通常都采用基础培养基如DMEM或a MEM添加一定比例FBS作为完全培养液。虽然这些传统组分能够维持MSC体外培养的干细胞特性，但FBS成分的不确定性及异源性限制了 MSC的下游研究及治疗应用。因此胎牛血清的残留问题为人脐带间充质干细胞临床应用亟待解决的问题。吴祖泽、裴雪涛等在文献“临床研究用间充质干细胞的体外制备策略”中报道使用无血清培养体系解决牛血清残留的问题。目前市面上已经有商品化MSC无血清培养基在售，但其价格昂贵，因此，无血清培养基应用于MSC产业化扩增十分不理想。同时根据《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》相关规定，干细胞生产过程中如使用商品化培养基必须提供其详细成分，但由于涉及商业秘密商家通常并不告知详细成分，因此其临床应用的安全性仍然存在隐患。此外，有诸多研究文献中提及各种牛血清替代因子，如血小板裂解因子等，但其属于血液类制品及其价格同样限制了在MSC产业化中的应用。《中国药典》2010版第3部《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程》中明确规定细胞培养液中不得含有人血清。而对于必须使用FBS作为原辅料的药品，中国药典均提出了相关质量要求，其中最为重要且最有代表的一项指标便是牛血清残留量，通常以牛血清白蛋白作为检测指标。目前，尚无任何法律法规对细胞类产品的牛血清残留进行质量标准规范。《中国药典》2010版第3部对疫苗类产品作出了明确的质量要求，要求其牛血清残留量不得超过50ng/剂。hUC-MSC临床拟用给药剂量参考文献:Jun Liang.Allogenic mesenchymal stem cells transplantat1n in refractory systemic lupuserythematosus:a pilot clinical study.Ann Rheum Dis 2010;69:1423 - 1429，通常为IXlO6个细胞/kg。若以平均体重50kg计，一剂MSC的细胞量为6X10 7个细胞。参考《中国药典》中疫苗牛血清残留质量标准，则注射用hUC-MSC牛血清残留量不得超过Ing/百万细胞。使用传统胎牛血清培养MSC的工艺很难达到此质量要求。牛血清残留量的超标可直接导致MSC临床应用上的过敏反应，安全性不容忽视。因此建立一种规模化并有效控制牛血清残留量的人脐带间充质干细胞的制备方法势在必行。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于解决上述问题，提供一种可有效控制hUC-MSC原料细胞中的牛血清残留量的方法。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
一种人脐带间充质干细胞规模化制备的方法，包括以下步骤:
(1)取脐带组织，用含双抗的D-hank’S液浸泡消毒；
(2)将脐带剪成I?2cm;
(3)再采用D-hank’s液反复洗涤，去除残留血液；
(4)将脐带继续减碎洗涤，至洗涤液澄清无血色；
(5)从脐带中分离提取hUC-MSC单细胞悬液； (6)以DMEM/F12+10%FBS为完全培养液，将hUC-MSC单细胞于5%C02、37°C培养箱内培养，且每2?3天更换一次培养液；
(7)待细胞融合度约80%时，消化传代；
(8)重复步骤(6)?(7)若干次；
(9)重复步骤(8)，其中以DMEM/F12+5%FBS+5%PHE 代替 DMEM/F12+10% FBS ；
(10)重复步骤(8)若干次，其中以DMEM/F12 + 10% PHE 代替 DMEM/F12 +10% FBS ；
(11)待细胞融合度约80%时，胰酶消化；
(12)收集细胞悬液，2000Xg，5min离心；
(13)弃上清液，获得hUC-MSC细胞沉淀。
[0010]其中，FBS为胎牛血清，PHE为胎盘匀浆液。
[0011]上述胎盘匀浆液的制备方法如下:
(1)取脐带同源胎盘，剥离羊膜，收集绒毛组织；
(2)缓冲液充分洗涤绒毛组织中残留血液；
(3)将绒毛组织进行匀浆，并用基础培养液稀释组织匀浆；
(4)在-80°C的条件下冻存；
(5)在4°C的条件下解冻；
(6)重复步骤(4)?(5)，使组织匀浆反复冻融两次；
(7)在4°C的条件下解冻后，采用超声波进行破碎；
(8)12000Xg，20min，4°C离心，收集上清液，然后对上清液进行过滤，收集滤液，即得胎盘匀浆液。
[0012]值得说明的是，胎盘匀浆液需在-80°C的条件下进行保存。
[0013]本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果:
(I)本发明的方法制备的间充质干细胞，其牛血清残留量符合中国药典对相关制剂的要求，并能够长时间保存而不失其活性，且操作简单易行。经过流式细胞检测，以及体外分化实验鉴定，胎盘匀浆液代替FBS培养得到的hUC-MSC其细胞形态、分子表面抗原及成脂成骨分化潜能与FBS培养获得的MSC —致，均符合国际细胞治疗协会对MSC鉴定的最低标准的规定。安全性方面，通过体外致瘤性检查，结果表明无明显变化。本发明的方法具有广阔临床应用前景。
[0014](2)本发明中将胎牛血清和脐带同源胎盘匀浆液相结合，用于hUC-MSC的体外规模化制备，既保