一套用于炭疽杆菌检测的多核苷酸、方法和试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一套生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一套用于炭疽杆菌检测 的多核苷酸、方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 炭疽杆菌（Bacillusanthraci)归属于芽胞杆菌属（Bacillus)。炭疽杆菌能引起 羊、牛、马等动物及人类的炭疽病。炭疽杆菌曾被帝国主义作为致死战剂之一。平时，牧民、 农民、皮毛和屠宰工作者易受感染，故已引起世界多国相关部门的重视。
[0003] 目前炭疽杆菌的检测方法分为两类，一类是传统的培养及其改进方法，依赖于生 化与形态学特点，检测周期较长，可操作性差；一类是聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR)相关方法，包括普通PCR方法以及实时荧光PCR方法，主要是针对炭疽杆菌 区别于芽胞杆菌属其它细菌的多个靶基因，选择特异序列，建立PCR以及实时荧光PCR方 法。炭疽杆菌PCR相关检测方法近年来发展迅速，由于其快速、灵敏、特异的特性，已经成为 食源性病原微生物的可靠检测方法。
[0004] 质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在 PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定 量分析的标准曲线。目前质粒DNA分子作为基因检测的标准物质得到了越来越多的深入研 究和应用，但是针对炭疽杆菌实时荧光PCR检测方法的质粒DNA标准物质还是空白。在实 际炭疽杆菌实时荧光PCR时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品， 其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确 度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一套适用于炭疽杆菌实时荧光定量PCR检测的质粒标准 分子及其应用。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一套分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含炭疽杆菌的 大分子毒素基因PA基因序列和/或炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因序列。
[0007]在另一优选例中，所述炭疽杆菌大分子毒素基因PA的基因序列选自下组：
[0008] (a)序列如SEQIDNO. : 3所示的多核苷酸序列；
[0009] (b)核苷酸序列与SEQIDNO. :3所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0010](C)序列与SEQIDNO. : 3所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQID NO. : 3所示序列长度的20% -100% (较佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0011] (d)与（a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
[0012] 在另一优选例中，所述炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因序列选自下组：
[0013] (a)序列如SEQIDNO. :1所示的多核苷酸序列；
[0014] (b)核苷酸序列与SEQIDNO. : 1所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0015] (c)序列与SEQIDNO. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQID NO. :1所示序列长度的20% -100% (较佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0016] (d)与（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
[0017] 在另一优选例中，所述多核苷酸含有炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因序列 和炭疽杆菌的大分子毒素基因PA序列，以及任选地连接两种基因序列的接头序列。
[0018] 在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQIDNO. :3所示。
[0019] 在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQIDNO. : 1所示。
[0020] 本发明的第二方面，提供了一套分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包含本发明 第一方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序列。
[0021] 在另一优选例中，所述DNA构建物中包含炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因序 列和炭疽杆菌的毒素PA的基因序列。
[0022] 在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。
[0023] 在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。
[0024] 在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为炭疽杆菌检测的标准分子（质粒标 准分子）。
[0025] 在另一优选例中，所述质粒或表达载体的骨架质粒选自下组：pUC19,pUC18， pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK和pGEM。
[0026] 在另一优选例中，所述质粒的序列如SEQIDNO:2或4所示。
[0027] 本发明的第三方面，提供了一套试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方面所述 的多核苷酸或者本发明第二方面所述的DNA构建物。
[0028] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述引物对特异性扩增炭疽杆菌 大分子毒素基因PA的基因序列。
[0029] 在另一优选例中，特异性扩增炭疽杆菌大分子毒素基因PA的基因序列的所述的 引物对选自下组：
[0030]SEQIDNO. :5 和SEQIDNO. :6 所示的引物对；
[0031]SEQIDNO. :7 和SEQIDNO. :8 所示的引物对；
[0032]SEQIDNO. :9 和SEQIDNO. : 10 所示的引物对；和
[0033]SEQIDNO. : 11 和SEQIDNO. : 12 所示的引物对。
[0034] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括引物对，所述所述引物对特异性扩增炭疽 杆菌的大分子荚膜基因capA基因序列。
[0035] 在另一优选例中，特异性扩增炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因序列的引物 对选自下组：
[0036]SEQIDNO. : 14 和SEQIDNO. : 15 所示的引物对；
[0037]SEQIDNO. : 16 和SEQIDNO. : 17 所示的引物对；和
[0038]SEQIDNO. : 18 和SEQIDNO. : 19 所示的引物对。
[0039] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列，所述探针序列如SEQ IDNO. : 13 所示。
[0040] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的探针序列，所述探针序列如SEQ IDNO. : 20 所示。
[0041] 本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的多核苷酸、本发明第二方面 所述的DNA构建物、或本发明第三方面所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于炭疽杆菌的 检测。
[0042] 在另一优选例中，所述检测为非诊断或治疗目的。
[0043] 在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。
[0044] 本发明的第五方面，提供了一套炭疽杆菌实时荧光定量PCR检测方法，所采用的 标准物质是如本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第二方面所述的DNA构建物。
[0045] 本发明的第六方面，提供了一套多核苷酸产品，所述产品包括：
[0046] (i)炭疽杆菌标准品，所述的标准品选自：本发明第一方面所述的多核苷酸或者 本发明第二方面所述的DNA构建物；
[0047] (ii)特异性扩增炭疽杆菌序列的引物对，所述引物对为：
[0048]SEQIDNO. :7和SEQIDNO. :8所示的序列构成的引物对；和/或
[0049]SEQIDNO. :9和SEQIDNO. : 10所示的序列构成的引物对。
[0050]在另一优选例中，所述的产品为多核苷酸的组合（combination)，较佳地所述组分 ⑴和（ii)是各自独立的。
[0051] 在另一优选例中，所述的产品为试剂盒形式。
[0052] 本发明的第七方面，提供了 一套炭疽杆菌的质粒标准分子的制备方法，包括以下 步骤：
[0053] ①人工合成炭疽杆菌的毒素PA基因序列和/或炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA 基因序列，所述炭疽杆菌的大分子荚膜基因capA基因序列和所述毒素PA表达基因序列分 别如SEQIDNO. : 1 和SEQIDNO:3 所示；
[0054] ②将步骤①所得基因序列克隆至克隆载体上，得到炭疽杆菌的质粒标准分子。
[0055] 在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19,pUC18,pUC118,pUC119， pBlueScriptIISK或pGEM。
[0056] 在另一优选例中，所述步骤②所述克隆载体为pUC19。
[0057] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于