一种卷曲链霉菌发酵生产卷曲霉素的培养基和培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种卷曲链霉菌发酵生产卷曲霉素的培养基和培养方法。
【背景技术】
[0002]卷曲霉素是由卷曲链霉菌发酵产生的环状多肽类抗生素，由4个结构相似的活性化合物——IA，IB, IIA和IIB组成，其中IA和IB的含量占80%?90%，是发挥疗效的主成分。卷曲霉素对耐多药及持留期结核分枝杆菌具有独特的疗效，被临床上确定为二线结核病治疗药物。
[0003]目前，国内卷曲霉素的发酵生产采用三级发酵模式，该方式存在的主要问题有以下几点:
[0004]I卷曲霉素发酵水平较低，其发酵水平维持在9000u/ml左右。
[0005]2常规培养基的速效碳源是葡萄糖，灭菌过程中易产生“美拉德反应”，即产生抑制菌体的有毒物质。
[0006]3卷曲霉素培养基中加入动物蛋白胨，增加了提取和纯化的难度。
[0007]4卷曲霉素补料工艺中加入部分前体物质，如甘氨酸、丝氨酸赖氨酸等，发酵液容易变色，增加了提取纯化的难度。
【发明内容】
[0008]本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种发酵工艺简单，有效提高发酵单位，同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现卷曲霉素稳定、高效生产的培养基。
[0009]本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产卷曲霉素的培养方法。
[0010]为实现上述目的所采取的技术方案为:
[0011]一种卷曲链霉菌发酵生产卷曲霉素的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
[0012]所述一级种子培养基的组成为:
[0013]豆油2?6ml/L、小麦麸皮12?16g/L、麦芽糖8?12g/L、麦芽糖酶0.002?0.006g/L、鱼粉9?13g/L、玉米浆12?16ml/L、一浸豆柏粉7?I lg/L、硫酸铵0.5?0.9g/L、轻质碳酸I丐I?5g/L ；
[0014]所述二级种子培养基的组成为:
[0015]豆油3?7ml/L、小麦麸皮15?19g/L、麦芽糖10?14g/L、麦芽糖酶0.003?
0.007g/L、鱼粉12?16g/L、蚕蛹粉4?9g/L、一浸豆柏粉7?llg/L、玉米蛋白粉10?14g/L、硫酸钱0.2?0.6g/L、轻质碳酸I丐I?5g/L ；
[0016]所述发酵培养基的组成为:
[0017]豆油6?10ml/L、小麦麸皮21?25g/L、麦芽糖26?30g/L、麦芽糖酶0.005?0.009g/L、鱼粉16?20g/L、蚕蛹粉10?14g/L、一浸豆柏粉14?18g/L、玉米蛋白粉13?17g/L、硫酸钱0.5?0.9g/L、轻质碳酸I丐3?7g/L、磷酸二氢钾0.1?0.5g/L、氯化钠0.002?0.006g/L、硫酸镁0.03?0.07g/L、硫酸亚铁0.1?0.5g/L、氯化锰0.003?
0.007g/L，氧载体0.1?0.5g/L、聚醚改性硅油0.3?0.7ml/L。
[0018]所述氧载体是正己烷或全氟化碳。
[0019]一种利用上述培养基生产卷曲霉素的培养方法，其特征在于其工艺步骤为:
[0020]I) 一级种子培养:首先将一级种子培养基灭菌并冷却至15?20°C，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的卷曲链霉菌母瓶发酵液按照0.1?0.2L/m3的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，至菌体浓度20?30%、pH值6?7、培养时间30?50h移种；
[0021]2) 二级种子培养:首先将二级种子培养基灭菌并冷却至15?20°C，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度30?40%、pH值6?7、培养时间40?50h时移入发酵培养基；
[0022]3)发酵培养:先将发酵培养基灭菌，冷却至15?20°C，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至菌体浓度35?45%、总糖< 8mg/100ml、氨基氮5?10mg/100ml、化学效价> 11500u/L、卷曲霉素I A+卷曲霉素I B含量> 85% ；pH5?7、培养时间140?150h时终止发酵。
[0023]所述一级种子培养基灭菌后的质量要求为:氨基氮30?40mg/100ml、溶磷20?30ug/ml、总糖 10 ?20mg/100ml、pH6 ?7。
[0024]所述二级种子培养基灭菌后的质量要求为:氨基氮35?45mg/100ml、溶磷30?40ug/ml、总糖 20 ?30mg/100ml、pH6 ?7。
[0025]所述发酵培养基灭菌后的质量要求为:氨基氮50?70mg/100ml、溶磷30?50ug/ml、总糖 30 ?50mg/100ml、pH6 ?7。
[0026]所述培养好的卷曲链霉菌母瓶发酵液质量要求为:pH6?7 ;菌体浓度25?30%;镜检无杂菌。
[0027]所述一级种子培养条件为:罐压0.03?0.05MPa ;罐温28?29°C;空气流量:0?15h，采用空气搅拌代替机械搅拌；16h?移种:20?40m3/h ;搅拌转速60?80r/min ；
[0028]所述二级种子培养条件为:罐压0.03?0.05MPa ;罐温28?30°C;空气流量40?60m3/h ;揽摔转速 60 ?80r/min ；
[0029]所述发酵培养条件为:
[0030]a培养基初始pH:发酵培养基灭菌后pH控制在6?7 ;
[0031]b温度:采用变温控制工艺，
[0032]O?50h:培养温度27?28°C，
[0033]51 ?130h:培养温度 29 ?30°C，
[0034]131h?发酵结束:培养温度27?28°C ；
[0035]c搅拌转速:采用变频搅拌控制工艺，
[0036]O ?80h:转速控制在 80r/min，
[0037]81 ?130h:转速控制在 110r/min，
[0038]131h?发酵结束:转速控制在80r/min ；
[0039]d压力控制:罐压0.05?0.06MPa ；
[0040]e pH控制:发酵过程中pH控制在5?7 ;
[0041]f空气流量:
[0042]O ?50h:150 ?200m3/h，
[0043]51 ?130h:200 ?300m3/h，
[0044]131h ?发酵结束:100 ?150m3/h ；
[0045]h溶氧控制:
[0046]发酵前50h内，不控制溶氧，
[0047]51?80h，溶氧控制在60%以上，
[0048]81?130h，溶氧控制在30%以上，
[0049]131?发酵结束:溶氧控制在40%以上。
[0050]所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补增效剂、补水、补硫酸铵、补麦芽糖和PH控制，其中
[0051]a补增效剂工艺控制:
[0052]在发酵周期分别达到80h，120h补入增效剂。
[0053]b补水工艺控制:
[0054]发酵前50h不用进行补水，
[0055]发酵时间在51?130h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40?45%，每隔6?8h检测发酵液菌体浓度，
[0056]发酵时间在131h?发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35?40%，每隔6?8h检测发酵液菌体浓度；
[0057]c发酵过程pH控制工艺:
[0058]发酵前80h，pH不进行控制，
[0059]发酵时间在81?130h，若pH < 6.0，采用流加法加入10?20%的氢氧化钠，调节pH至6?7，若pH > 7，采用流加法加入30%的硫酸溶液，调节pH至6?7，
[0060]发酵时间在131?发酵结束，若pH < 6.2，加入10?20%的氢氧化钠，调节pH控至6.2?6.6 ;若pH > 6.6，加入30%的硫酸溶液，调节pH至6.3?6.6 ;
[0061]d补入麦芽糖:
[0062]发酵前60h，总糖含量不进行控制，
[0063]发酵61h至130h:总糖含量< 20mg/100ml时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在20?25mg/100ml，
[0064]发酵131h至发酵结束:总糖含量< 5mg/100ml时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在5?10mg/100ml，
[0065]上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶，其浓度控制在0.001?0.003% ;
[0066]e补硫酸钱:
[0067]在发酵SOh和130h时补入10%的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01 ?0.03%。
[0068]所述增效剂为丝氨酸、赖氨酸、吐温-80和核黄素的混合溶液，其各自浓度控制在0.001?0.005% ;补料过程中，其用量为发酵液体积的0.01?0.03%。
[0069]豆柏是大豆提取豆油后得到的一种副产品。按照提取的方法不同，可以分为一浸豆柏和二浸豆柏二种。其中以浸提法提取豆油后的副产品为一浸豆柏，而先以压榨取油，再经过浸提取油后所得的副产品称为二浸豆柏。
[0070]本发明的技术优势体现在:
[0071]I本发明确认了种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。培养基中的碳源、氮源含有卷曲霉素生物合成过程中所需的关键物质，保证了卷曲霉素发酵的技术效果。
[0072]2本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述，确认了卷曲霉素最佳的发酵工艺和控制参数。通过本发明发酵生产卷曲霉素，其发酵单位达到11500u/ml以上，同国内技术相比，发酵单位提高了 15%以上。
[0073]3本发明中卷曲霉素I A+卷曲霉素I B含量> 85%，有效含量高于卷曲霉素药典中的下限要求。
[0074]4本发