用于cho细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药技术领域，涉及一种糖基化修饰的重组人甲状腺激素的工业化生产方法，尤其涉及一种可以稳定提高重组促甲状腺素表达量、缩短生产周期并且保持表达产物高品质的无血清培养基，糖基化修饰的重组人甲状腺激素的工业化生产方法。
【背景技术】
[0002]促甲状腺激素TSH (thyrotropin, thyroid stimulating hormone)是脑垂体分泌，促进甲状腺的生长和机能的大分子糖蛋白激素。人类的TSH含210个氨基酸，整个分子由α链亚单位和β链亚单位以非共价键方式连接而成，其中α链亚单位为TSH和促性腺激素(包括卵泡刺激素FSH、黄体生成素LH、HCG)共有，由92个氨基酸组成，β链亚单位是TSH特异性专有。糖链约占整个分子的15%，糖基化是TSH生物学活性所必须。
[0003]TSH作用位点主要是甲状腺细胞及含有TSH受体(TSH receptor, TSHR)的甲状腺癌细胞。TSH全面促进甲状腺的机能，其生理作用为促进甲状腺激素的合成和释放，促进T4、T3的合成，增强甲状腺细胞的钠/碘栗NIS (sodium/ 1dide symporter)的活性，增强过氧化物酶的活性，增加甲状腺球蛋白Tg合成及酪氨酸碘化等多个环节。TSH还能促进甲状腺上皮细胞的代谢及胞内核酸和蛋白质合成，使细胞增生、腺体增大。
[0004]1988年，人TSH的β链克隆成功，随后的研究将人TSH基因转染至中华仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CH0)中成功表达，获得重组人促甲状腺素a (rhTSH)，rhTSH和人体内生性的TSH有同样的氨基酸序列。
[0005]上市18年来，rhTSH已先后获批用于高分化甲状腺癌复发情况的诊断，以及与放射性碘(rad11dine)联合用于甲状腺癌患者摘除、破坏残余的甲状腺组织治疗，被国内外大量的临床试验研究所证实其安全有效，已在全球超过50个国家使用。在中国，甲状腺肿瘤发病率爆发性增长，但由于技术相关问题，该产品在中国没有上市。
[0006]目前国内尚无规模化生产重组人促甲状腺激素的报道。国际上，据公开资料显示，其生产工艺为使用悬浮的CHO细胞进行连续批次培养，即将细胞接种至生物反应器，培养一段时间后，从反应器中放出大部分细胞液，再接入新鲜培养基进行培养，如此重复。由于培养过程中，需要放出细胞液，接入新鲜培养基，并且需要重复进行几次，操作繁琐，因此容易产生污染的风险，并且对下游纯化造成很大负担。另外，这种生产方式存在同一个反应器培养，分批收获上清的问题，产品质量较难保证均一性。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于解决上述的技术问题，提供一种可高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其制备方法。
[0008]本发明的目的通过以下技术方案来实现:
一种用于CHO细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基，其特征在于:所述培养基包括无血清基础培养基、补料培养基和培养基添加剂，所述基础培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、微量元素、碳水化合物、表面活性剂及其他有机分子，所述补料培养基包括无机盐、氨基酸、维生素、微量元素、碳水化合物、大豆水解物及其他有机分子，所述培养基添加剂为D-半乳糖、尿嘧啶、Mn2+中的一种或一种以上的组合。
[0009]优选地，所述无机盐在每升所述基础培养基含有如下成分:
CaCl2 58-29Img ；KC1 155-776 mg ；MgS04 24-75 mg ；
MgCl2 30-142 mg ；NaCl 3490_17450mg ；NaHCO3 800-4000 mg；
NaH2PO4.H2O 32_158mg ；Na2HPO4 36_175mg ;柠檬酸铁 10~55 mg ；
所述氨基酸在每升所述基础培养基含有如下成分:
丙氨酸2.2-11.1mg ;精氨酸 74-368mg ;天冬氨酸100_275mg ;
天冬酰胺37-95mg ;半胱氨酸15-87mg ;胱氨酸33_89mg ；
谷氨酸140_367mg ;甘氨酸19_69mg ;组氨酸65_157mg ；
异亮氨酸 146-271mg ;亮氨酸 143_295mg ;赖氨酸 45.6_456mg ;
蛋氨酸19-86 mg ;苯丙氨酸45-177 mg ;脯氨酸21-150 mg ；
丝氨酸56-131 mg ;苏氨酸72-267 mg ;色氨酸4.5-45 mg ；
酪氨酸27-139mg ;缴氨酸44-264 mg ；
所述维生素在每升所述基础培养基含有如下成分:
生物素 0.002-0.02 mg ;泛酸钙 1.09-10.9 mg ;叶酸 1.32-13.2 mg ；
烟酰胺 1.01-10.1mg ;吡哆醛.HCl 1.009-10.1mg ;吡哆醇.HCl 0.015-0.15 mg ；核黄素 0.11-1.1mg ;硫胺素 1.09-llmg ;维生素 B12 0.35-3.5mg ；
所述微量元素在每升所述基础培养基含有如下成分:
七水硫酸锌 0.22-2.2mg ;五水硫酸铜0.0006-0.006mg ；
氯化铝 0.0010-0.01 mg ;四水钼酸铵 0.0002-0.002mg ；
醋酸钡 0.0005-0.005 mg ;氯化镉 0.003-0.03 mg ；
六水氯化铬 0.0001-0.001 mg ;六水氯化钴 0.0004-0.004 mg ；
二氧化锗 0.0001-0.001 mg ;六水氯化镍 0.00003-0.0003 mg ；
溴化钾 0.000021-0.00021 mg ;碘化钾 0.000032-0.00032 mg ；
硝酸银 0.000032-0.00032 mg ;柠檬酸钠 0.106-1.06 mg ；
四氯化钛 0.0001-0.001 mg ;八水氧氯化锆 0.00056-0.0056 mg ；
所述碳水化合物及有机分子在每升所述基础培养基含有如下成分:
葡萄糖 1800-9000mg ；1-肌醇 6.25-62.5mg ;丙酮酸钠 27.5-275 mg ；
亚油酸 0.021-0.2Img ;亚麻酸 0.001-0.0lmg ;硫辛酸 0.053-0.53 mg ；
腐胺.2HC1 0.04-0.4 mg ;甲醇胺 0.005-0.05mg ;精胺 0.005-0.05mg ；
硫代甘油0.01-0.1 mg ;氧化胆碱4.48-44.8 mg ;次黄嘌呤钠1.19-11.9 mg ；
胸苷 0.18-1.8 mg ;酚红 0.002-0.007mg ；
所述表面活性剂为Pluronic F68，其在每升所述基础培养基中的成分含量为500-2000
mg ο
[0010]优选地，所述补料培养基浓度为70g/L。
[0011 ] 优选地，所述培养基添加剂的含量分别为D-半乳糖500_5000mg/L、尿嘧啶100-1000mg/L、Mn2+ 1-20 μ mol/L0
[0012]优选地，所述补料培养基的成分为无机盐、氨基酸、维生素、微量元素及碳水化合物、有机分子和水解物，其中
所述无机盐在每升所述补料培养基含有如下成分:
CaCl2 180-291mg ；KC1 155-355 mg ；MgS04 34-80 mg ；
MgCl2 80-152 mg ；NaCl 1870_6750mg ；NaHCO3 800-4000 mg；
NaH2PO4.H2O 95_258mg ；Na2HPO4 86_200mg ;柠檬酸铁 44-65 mg ；
所述氨基酸在每升所述补料培养基含有如下成分:
丙氨酸 8.9-11.1mg ;精氨酸 234-368mg ;天冬氨酸 200_275mg ；
天冬酰胺58-100mg ;半胱氨酸55-100mg ;胱氨酸67_89mg ；
谷氨酸280_365mg ;甘氨酸50_70mg ;组氨酸90_160mg ；
异亮氨酸211-280mg ;亮氨酸200_300mg ;赖氨酸 250_450mg ;
蛋氨酸60-90 mg ;苯丙氨酸150-180 mg ;脯氨酸95-155 mg ；
丝氨酸89-13