一种含有可调控表达的cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种真核表达载体及其构建方法，具体涉及一种含有可调控表达的Cre重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002]乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染仍然是全球性的公共卫生问题，估计全世界HBV携带者高达3.5亿。我国是乙型肝炎高流行区，人群HBV携带率约为10%，其中部分慢性肝炎患者可演变成肝硬化或肝癌。
[0003]HBV的致病机制尚未完全清楚。HBV侵入机体后，主要在肝细胞内复制产生完整的病毒颗粒并分泌或表达表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)以及核心抗原(HBcAg)等病毒抗原成分。在血液或肝细胞膜上的病毒抗原可诱导机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答。大量的研究结果表明，机体对HBV的免疫效应具有双重性:既可清除病毒，也可造成肝细胞的损伤。
[0004]HBV的体外实验模型目前采用的是病毒DNA转染的细胞培养系统，可用于筛选抗HBV药物。由于HBV具有较高的宿主特异性，只能自然感染人和黑猩猩等灵长类动物。黑猩猩感染HBV后可出现类似人急性肝炎的免疫病理变化，是乙型肝炎比较理想的动物模型，但其来源困难且价格昂贵，无法推广使用。近年来有学者发现与黑猩猩种系发生关系较为接近的树駒也可以感染HBV，但目前研究显示树駒的实验室HBV感染率偏低，而且通常只表现为轻度的暂时性HBV感染，体内病毒滴度不高。此外，鸭乙型肝炎病毒(DHBV)与土拨鼠肝炎病毒(WHV)等可在其相应的天然宿主中形成类似人乙型肝炎的感染，特别是DHBV因其动物宿主来源方便，在国内、外被广泛采用。但上述动物模型在实际应用中也存在明显的缺点:①体型均较大，实验室饲养和操作不便，而且通常不易获得；②均为远交系动物，遗传和免疫学背景不清；③不同种动物肝炎病毒在基因组结构等多个方面与人HBV存在较大差异，特别是鸭乙型肝炎病毒。因此长期以来由于缺乏理想的小动物模型，有关HBV致病机制等关键问题的研究受到很大影响。
[0005]小鼠具备遗传和免疫学背景清楚等多方面的优点，因此HBV小鼠模型的建立一直是HBV研究的热点和难点之一，特别是HBV转基因小鼠模型的研究被认为是解决HBV宿主特异性这一难题非常有前途的方法之一。但目前的HBV转基因小鼠模型存在的最大缺点是:小鼠从胚胎发育阶段就开始持续性地表达病毒抗原，导致小鼠出生后对病毒抗原无法产生免疫应答，即小鼠对HBV处于完全免疫耐受状态，小鼠的肝脏也不能产生类似人乙型肝炎的免疫病理变化，这就大大削弱了转基因小鼠模型在HBV的致病机制，以及HBV感染后宿主免疫反应等关键问题研究方面的应用价值。因此，转基因小鼠模型对HBV的免疫耐受难题不解决，必将大大削弱转基因小鼠在HBV感染的致病机理以及HBV感染后宿主免疫反应等关键问题研究方面的应用价值。
[0006]为了克服上述缺点科研人员开发出了多种可调控型的转基因技术。其中Bujard等建立的四环素调控系统是目前最具代表性的条件性基因表达调控系统之一，这个系统包括早期开发的Tet-off系统和经过改进的Tet-on系统两种类型。虽然Tet-on系统在降低rtTA毒性以及提高反应速度等方面较Tet-off系统均有了很大提高，但该系统的漏过性表达(即未诱导时的背景表达)问题只是较Tet-off系统有所改善而已，单纯应用Tet-on系统仍然难以克服胚胎期免疫耐受难题。
[0007]综上所述，建立一种既可以突破胚胎期免疫耐受，又可以使HBV在体内长期、稳定复制的HBV转基因小鼠模型，用于对HBV致病机制、抗病毒药物和疫苗的筛选，对早日解决HBV对人类健康的危害都非常重要。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种含有可调控表达的ere重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体及其构建方法和应用。
[0009]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0010]本发明公开了一种含有可调控表达的ere重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体，该表达载体为pB1-3-LacZ-cre，且该表达载体中含有LacZ报告基因、ere重组酶基因及双向启动子tetO元件。
[0011]所述ere重组酶基因的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
[0012]本发明还公开了一种含有可调控表达的ere重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体的构建方法，该真核表达载体PB1-3的双向启动子tetO的一侧为LacZ报告基因，在另一侧插入ere重组酶基因，构建得到真核表达载体pB1-3-LacZ-cre。
[0013]优选地，该含有可调控表达的ere重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体的构建方法，包括以下步骤:
[0014]I)以引物对Pl为引物，以包含ere重组酶基因的pET32a_cre载体为模板，PCR扩增基因，得到ere重组酶基因扩增片段；
[0015]2)用限制性内切酶Pst I和Sal I双酶切表达载体pB1-3_LacZ并回收大片段产物，将ere重组酶基因扩增片段用限制性内切酶Pst I和Sal I进行双酶切，并回收产物；
[0016]3)将步骤2)酶切回收的两个产物用T4DNA连接酶连接，得到含有可调控表达的ere重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体pB1-3-LacZ_cre。
[0017]步骤I)所述的引物对Pl为:
[0018]上游引物:AACTGCAGGCCACCATGGCCAATTTACTG；
[0019]下游引物:ACGCGTCGACCTAATCGCCATCTTCCAGCAG；
[0020]步骤2)所述的大片段产物包含插入的ere重组酶基因和调控元件，大小为7521bp0
[0021]所述ere重组酶基因的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
[0022]本发明还公开了含有可调控表达的ere重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体在抗HBV抑制剂筛选中的应用。
[0023]本发明还公开了一种构建肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠的方法，首先，将权利要求1所述的表达载体导入小鼠输卵管内进行妊娠，获得转基因小鼠；然后，将可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的ΓΤΑ?ΑΡ-1转基因小鼠、可调控表达HBV基因组的HBV Tg小鼠和转基因小鼠进行杂交，经反复交配，得到肝脏可诱导表达的Tet-on联合Cre/loxP的双调控策略的三转基因小鼠。
[0024]在可诱导肝脏特异性表达rtTA分子的ΓΤΑ?ΑΡ_1转基因小鼠的表达载体中含有肝脏特异性启动子和rtTA元件。
[0025]可调控表达HBV基因组的HBV Tg小鼠的表达载体为pB1-3-Luc-pA-HBVTg-EGFP，含有 LacZ 报告基因-双向启动子 tetO-loxP-Luciferase-polyA-loxP-HBVTg-1RES-EGFP报告基因的元件。
[0026]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0027]本发明公开了一种含有可调控表达的ere重组酶基因和报告基因LacZ的表达载体及其构建方法，该表达载体中含有LacZ报告基因、ere重组酶基因及双向启动子tetO元件。该表达载体的ere重组酶基因的表达需要在盐酸强力霉素(Dox)诱导其他载体表达的rtTA分子与tetO双向启动子特异性结合后启动，tetO双向启动子一端可启动ere重组酶基因表达，另一端可启动报告基因LacZ的表达。该表达载体可应用于由rtTA分子启动的ere重组酶基因表达的所有基于Cre/loxP重组酶条件性敲除的系统，并且该ere重组酶基因的表达可由LacZ报告基因的表达进行观察。
[0028]本发明还公开了基于表达载体pB1-3-LacZ-cre构