一种东稻4号快速遗传转化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种"东稻4号"遗传转化的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是全球超过一半人口赖W生存的重要粮食作物，同时也是单子叶植物基因组 学遗传和功能研究的模式植物，不可替代的重要性使其倍受重视。随着基因工程和农业生 物技术的发展，遗传转化成为水稻遗传改良的一种重要辅助手段，受到全世界水稻育种家 的青睐。
[0003] 农杆菌介导的遗传转化是水稻转基因的首选方法，也是水稻遗传改良的有效手 段。农杆菌介导的水稻遗传转化可追溯到1986年，直到1998年才建立了高效的转基因体 系。自此W后，农杆菌介导的水稻遗传转化研究迅速发展，并显示出广阔的应用前景。
[0004] 基因型是影响水稻遗传转化的主要因素之一。尽管目前利用农杆菌转化梗稻、 釉稻和爪哇稻都获得了成功，但不同品种对农杆菌的敏感度不同。"东稻4号"（吉审稻 2010005)是本课题组自主培育的超高产优质耐盐碱水稻品种，其在2010年度吉林省水稻 新品种高产竞赛中荣获一等奖，折合标准水后亩产达849. 37公斤，在参赛的所有水稻品种 中位列第一，单产超过吉林省目前大面积推广的超级稻品种"吉梗88" (786. 94公斤/亩， 第二名），创下吉林省水稻超高产品种历史最高纪录。2011年东稻4号"荣获全国优良食 味品评一等奖，在气味、外观结构、适口性和味道四个方面均具有较高的评价。"东稻4号" 品种水稻打破了人们对水稻"产量"和"品质"不能兼得的传统观念，具有重要的应用前景。 但是，目前已经建立的水稻遗传转化体系并不适用于"东稻4号"，且经典的农杆菌介导的 水稻转基因方法，一般需要150d左右，周期较长，大大限制了水稻转基因技术的发展。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是要解决目前"东稻4号"遗传转化的周期较长的问题，提供一种 "东稻4号"快速遗传转化的方法。
[0006] 本发明一种"东稻4号"快速遗传转化的方法包括W下具体步骤：
[0007] -、将"东稻4号"水稻种子脱颖壳，然后进行消毒再接种到水稻诱导培养基上；
[0008] 二、水稻胚性愈伤组织的诱导和预培养：在28°C全光照条件下，将步骤一接种后 的水稻诱导培养3~4周，得水稻胚性愈伤组织；然后置于N抓培养基28°C光照预培养5d ;
[0009]=、农杆菌浸染和共培养：将预培养后的愈伤组织置于AAM重悬菌液中摇动90s 后，置于3层无菌滤纸上，去除农杆菌菌液，然后将愈伤组织转入共培养基中，在黑暗的条 件下共培养3d ;
[0010] 四、愈伤组织脱菌及筛选：将共培养后的愈伤组织进行脱菌，然后在28°c全光照 条件下，在选择培养基上筛选获得抗性愈伤组织；
[0011] 五、将抗性愈伤组织转移到分化培养基上，分化培养获得抗性植株；
[0012] 六、将抗性植株壮苗、炼苗、移栽，即完成"东稻4号"的遗传转化。
[0013] 本发明大大缩短了水稻转基因周期。常规的水稻转基因体系一般需要150d左右， 而本发明经过21-28d的愈伤组织诱导，5d的愈伤组织预培养，农杆菌浸染和共培养共4山 抗性愈伤组织筛选14-21d，抗性愈伤组织分化成苗14-28d，壮苗、炼苗、移栽共10-15山总 计68-lOOd左右，比原有方法节省50-82d的时间。本发明采用的是28°C全光照，不需要更 换培养条件，简化了实验流程，省时省力。
【附图说明】
[0014] 图1为实施例一中步骤二水稻胚性愈伤组织的照片；
[0015] 图2为实施例一中步骤二预培养后愈伤组织的照片；
[0016]图3为实施例一中步骤四抗性愈伤组织的照片；
[0017] 图4为实施例一中步骤五抗性植株的照片；
[0018] 图5为实施例一中步骤六壮苗时的照片；
[0019] 图6为实施例一抗性植株PCR鉴定的图片。
【具体实施方式】
[0020]
【具体实施方式】一：本实施方式一种"东稻4号"快速遗传转化的方法包括W下具体 步骤：
[0021] 一、将"东稻4号"水稻种子脱颖壳，然后进行消毒再接种到水稻诱导培养基上；
[0022] 二、水稻胚性愈伤组织的诱导和预培养：在28°C全光照条件下，将步骤一接种后 的水稻诱导培养3~4周，得水稻胚性愈伤组织；然后置于N抓培养基28°C光照预培养5d;
[0023]=、农杆菌浸染和共培养：将预培养后的愈伤组织置于AAM重悬菌液中摇动90s 后，置于3层无菌滤纸上，去除农杆菌菌液，然后将愈伤组织转入共培养基中，在黑暗的条 件下共培养3d;
[0024] 四、愈伤组织脱菌及筛选：将共培养后的愈伤组织进行脱菌，然后在28°C全光照 条件下，在选择培养基上筛选获得抗性愈伤组织；
[00巧]五、将抗性愈伤组织转移到分化培养基上，分化培养获得抗性植株；
[0026] 六、将抗性植株壮苗、炼苗、移栽，即完成"东稻4号"的遗传转化。
[0027] 本实施方式中N6D培养基配方：N6I号溶液+N6II号溶液+N6III号溶液+N6IV号 溶液+N6 V号溶液脯氨酸巧，4-D化Omg/L) +薦糖（30g/L) +结冷胶化25 % )，P册.8。
[0028] 本实施方式大大缩短了水稻转基因周期。常规的水稻转基因体系一般需要150d 左右，而本实施方式经过21-28d的愈伤组织诱导，5d的愈伤组织预培养，农杆菌浸染和共 培养共4d，抗性愈伤组织筛选14-21d，抗性愈伤组织分化成苗14-28d，壮苗、炼苗、移栽共 10-15山总计68-lOOd左右，比原有方法节省50-82d的时间。本实施方式采用的是28°C全 光照，不需要更换培养条件，简化了实验流程，省时省力。
【具体实施方式】 [0029] 二：本实施方式与一不同的是：步骤一所述的消毒是 在超净工作台内，用质量浓度为70 %的乙醇浸泡Imin，无菌水洗涂5次，然后用50 %的 化CIO振荡消毒15min，用无菌水冲洗5~10次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分，即完 成。其它步骤和参数与一相同。
[0030]
【具体实施方式】=:本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是：步骤=所述的 AAM重悬菌液的制备方法：在超净工作台上，将农杆菌接种于含50mg/L卡那霉素的LB固体 平板培养基，用封口膜封口后，放在培养箱中，25°C、倒置、暗培养2~3d后，挑取一单菌落 接种于于含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中，25°C，120巧m振荡培养36h，离屯、收集菌 体沉淀，用添加20mg/L乙酷下香酬的AAM培养基重新悬浮菌液，得到AAM重悬菌液。其它 步骤和参数与【具体实施方式】一或二相同。
[0031] 本实施方式中AAM培养基配方为：AAM I号溶液+AAM II号溶液+AAMIII号溶液 +AAM IV号溶液+氨基酸类+乙酷下香酬（20mg/L) +薦糖化8. 5g/L) +葡萄糖（36g/L) +结冷 胶 〇). 25% )，抑5. 2。
【具体实施方式】 [0032] 四：本实施方式与一至=之一不同的是：步骤=所述 的共培养基为2N6-AS培养基。其它步骤和参数与一至=之一相同。
[0033] 本实施方式中2N6-AS培养基配方为：N6 I号溶液+N6 II号溶液+N6III号溶液 +N6 IV号溶液+N6 V号溶液+2,4-二氯苯氧乙酸化0mg/L)+乙酷下香酬（20mg/L) +薦糖 (30g/L) + 葡萄糖（l〇g/U + 结冷胶 0). 25% )，抑5. 2。
【具体实施方式】 [0034] 五：本实施方式与一至四之一不同的是：步骤四所述 的脱菌方法为用含有25mg/L的Meropen的无菌水摇动清洗10次，清洗后用无菌滤纸吸干 水分，即完成。其它步骤和参数与一至四之一相同。
【具体实施方式】 [0035] 六：本实施方式与一至五之一不同的是：步骤四所述 的选择培养基为含有10~15mg/LHg和25mg/L Meropen的N抓培养基。其它步骤和参数 与一至五之一相同。
[0036] 本实施方式中N6D培养基配方：N6 I号溶液+N6 II号溶液+N6III号溶液+N6 IV号 溶液+N6 V号溶液脯氨酸巧，4-D化Omg/L) +薦糖（30g/L) +结冷胶化25 % )，P册.8。
【具体实施方式】 [0037] 屯：本实施方式与一至六之一不同的是：步骤五所述 的分化培养的方法为：在28°C的条件下，光照培养，每15天换一次培养基，直到分化出苗。 其它步骤和参数与一至六之一相同。
【具体实施方式】 [0038] 八：本实施方式与一至屯之一不同的是：步骤五所述 的分化培养基为含有10~15mg/LHg和25mg/L Meropen的REIII培养基。其它步骤和参 数与一至屯之一相同。
[0039] 本实施方式中REIII培养基的配方为：RE-IIII号溶液+RE-III II号溶液 +RE-IIIIII 号溶液+RE-IIIIV 号溶液（即 N6IV 号溶液）+肌醇+Casammo acid+NAA(0. 02mg/ L)+Kmetm(激动素 2mg/L) + 薦糖（30g/L)+Sorbitol (山梨醇 30g/L)+ 结冷胶 0). 25 % )， 抑5. 8 ;
【具体实施方式】 [0040] 九：本实施方式与一至八之一不同的是：步骤六所述 的壮苗、炼苗和移栽的方法为