一种黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶CsUGT78A14基因及其编码蛋白和应用

一种黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶CsUGT78A14基因及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及的是一种从茶树鲜叶中分离获得的黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶CsUGT78A14基因及其编码蛋白和应用。
【背景技术】
[0002]多酚化合物是茶树中主要的次生代谢产物，与茶叶品质及人体保健密切相关，其中，儿茶素(黄烷3-醇)，黄酮醇及它们的衍生化产物如酯型儿茶素和黄酮醇3-0-糖苷是决定茶叶品质和质量的重要组成成分。在2005年，Scharbert和Hofmann的研究中，他们挑选了一些标准品化合物包括15种氨基酸，14种黄酮醇糖苷，8种黄烷3-醇，5种茶黄素，5种有机酸，3种糖和咖啡因作为茶叶涩味的研究对象，通过这些化合物在红茶茶汤中的真实含量，用标准品混合水溶液模拟了和红茶类似的口感。发现包含苦味的咖啡因，9种柔和涩味的黄酮醇3-0-糖苷，儿茶素以及苦涩酯型儿茶素EGCG的混合水溶液与茶饮料水溶液口感一致，因此确定这12种化合物是茶叶中非常重要的决定红茶口感的化合物。并且，附加的感官审评研究表明黄酮醇3-0-糖苷不仅赋予茶饮料柔和涩味的口感而且通过增强咖啡因的苦味而增加了茶汤苦感。因此，这些化合物被认为是比茶红素和茶黄素更典型的决定红茶茶汤口感的化合物，而黄酮醇糖苷化合物作为仅次于儿茶素含量的酚类化合物以很低的阈值赋予茶叶柔和湿感，尿苷二磷酸糖依赖的糖基转移酶(UDP-glycosyltransferases，UGTs)是参与茶叶中黄酮醇糖苷合成的关键酶类。因此，一种黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶在改善茶饮料滋味方面具有潜在的应用价值。

【发明内容】

[0003]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种从茶树鲜叶中分离获得的黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶CsUGT78A14基因及其编码蛋白和应用，以提供一种新的能够编码茶树黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶基因及其编码蛋白。
[0004]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0005]本发明提供了一种黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶CsUGT78A14基因，该基因从茶树鲜叶中分离获得，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0006]本发明还提供了上述黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶CsUGT78A14基因在改善茶饮料滋味中的应用。
[0007]本发明还提供了一种上述黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶CsUGT78A14基因的编码蛋白，所述编码蛋白具有如SEQ ID NO:2所不的氣基酸序列。
[0008]本发明还提供了上述黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶CsUGT78A14基因的编码蛋白在改善茶饮料滋味中的应用。
[0009]本发明还提供了一种含有上述黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶CsUGT78A14基因的重组质粒。
[0010]所述重组质粒为将上述黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶CSUGT78A14基因连接到pMal-c2X载体的多克隆位点中构建获得，命名为pMal-c2X-CsUGT78A14。
[0011]本发明还提供了一种转基因工程菌，所述转基因工程菌含有上述重组质粒，或其基因组中整合有外源的黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶CsUGT78A14基因序列。
[0012]所述转基因工程菌为含有上述重组质粒，或其基因组中整合有外源的黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶CsUGT78A14基因序列的大肠杆菌Novablue (DE3)菌株。
[0013]本发明相比现有技术具有以下优点:本发明提供了一种黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶CsUGT78A14基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了形成茶饮料柔和涩味相关的黄酮醇3-0-葡萄糖基转移酶基因CsUGT78A14功能，本发明还提供了含有CsUGT78A14基因的重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白，为开发具有改善茶叶滋味的酶类或工程微生物，深化茶饮料加工，开发不同滋味茶饮品，奠定了坚实基础。
【附图说明】
[0014]图1是pMal_c2X载体的质粒图谱；
[0015]图2是以VvGTl的晶体模型2c9z为模版创建的CsUGT78A14的蛋白晶体模型；
[0016]图3是CsUGT78A14重组蛋白(rCsUGT78A14)的SDS-PAGE蛋白电泳分析图；其中，M为蛋白Marker ；1为重组质粒诱导前；2为重组质粒诱导后；3为诱导后破碎后上清；4为诱导后破碎后沉淀；5为纯化后蛋白。
[0017]图4是HPLC分析rCsUGT78A14催化的酶活产物结果图；其中，图4-A?4-C分别是以UDP-葡萄糖为糖供体，以黄酮醇化合物山奈素，槲皮素和杨梅素作为糖受体的HPLC图谱；
[0018]图5是rCsUGT78A14催化合成黄酮醇3_0_葡萄糖苷产物的一级质谱和二级质谱分析图谱；其中，图5-A为山奈素3-0-葡萄糖苷的一级质谱和二级质谱分析图谱；图53槲皮素3-0-葡萄糖苷的一级质谱和二级质谱分析图谱；图5-C为杨梅素3-0-葡萄糖苷的一级质谱和二级质谱分析图谱。
【具体实施方式】
[0019]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0020]实施例1
[0021]一、材料
[0022]1、茶树品种:农抗早(Camellia sinensis (L.) 0.Kuntze.var.sinensis cultivarNongkangzao)，采集茶树鲜叶，迅速用液氮冷冻，储存于_80°C冰箱中备用；
[0023]2、pMal-c2X载体:其质粒图谱如图1所示；
[0024]3、大肠杆菌Novablue (DE3)表达宿主菌:购于上海北诺生物科技有限公司；
[0025]4、LB培养基:称取1g的NaCl，5g的酵母提取物，1g的胰蛋白胨，加入950mL去超纯水搅拌溶解，用lmol/L的NaOH调pH至7.0，加水定容至lOOOmL，高压蒸汽灭菌15min，即获得LB液体培养基，LB固体培养基为在LB液体培养基中加入15g的琼脂粉即可；
[0026]5、质量比为40%的葡萄糖溶液:称取40g葡萄糖，加入超纯水溶解搅拌均匀，定容至 10mL, 110°C灭菌 1min ；
[0027]6、氨节青霉素母液(Amp+，100mg/mL):称取Ig氨节青霉素Amp，溶于1mL灭菌水，过滤除菌，分装小管，_20°C保存；
[0028]7、lmol/L的IPTG (异丙基硫代-β -D-半乳糖苷):称取2.383g IPTG，溶于灭菌超纯水，定容至10mL，过滤除菌，分装并于_20°C保存；
[0029]8、蛋白纯化缓冲液:包括上柱缓冲液和洗脱缓冲液，:
[0030]上柱缓冲液:称取0.37g 的 EDTA, 11.67g 的 NaCl, 2.42g 的 Tris, 0.15g 的 DTT 于足量纯水中，搅拌使其充分混匀；用稀盐酸调其PH至7.4，定容至1L，即得上柱缓冲液；[0031 ] 洗脱缓冲液:IL上柱缓冲液中加入3.60g麦芽糖，溶解搅拌均匀；
[0032]9、10mM的ρΗ7.5的Tris-HCL缓冲溶液:称取1.1214gTris加水至90mL搅拌溶解均匀，加稀HCL调pH至7.5，补水定容至10mL ；
[0033]10、体积比为I %的乙酸:用移液管量取1mL色谱级乙酸溶液于IL容量瓶中，用超纯水定容至1L。
[0034]二、CsUGT78A14 基因的克隆:
[0035]1、设计带有表达载体pMal_c2X载体的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列如 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4 所示:
[0036]SEQ ID NO:3:正向引物:5，-TCTAGAATGAACGGTGACTCCCAACAACACC-3’
[0037]SEQ ID NO:4:反向引物:5’ -GTCGACTTAAGGGTGCTTACAAGCTTTGATTACC-3’ ；
[0038]2、按照TaKaRa RNAiso试剂盒和RNAiso Plus试剂盒说明书，提取茶树品种农抗早鲜叶RNA，并反转