一种苹果酸酶基因rkme1及其重组表达载体的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种苹果酸酶(Malic enzyme)基因及其重组表达载体，具体涉及以红冬抱酵母(Rhodosporidium kratochvilovae) YM25235 cDNA为模板，扩增得到编码苹果酸酶(ME)的基因欣通57，将其连接至表达载体，进一步转化至大肠杆菌BL21中，诱导表达，镍柱亲和层析纯化重组蛋白，并对纯化后的蛋白进行了酶活测定。属于微生物基因工程和酶工程领域。
【背景技术】
[0002]苹果酸酶(malic enzyme，ME)是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧为丙酮酸和C02，同时伴随着NAD(P)+的还原；苹果酸酶普遍存在于生物体内；根据辅酶因子的不同，苹果酸酶可分为两种:NAD_苹果酸酶(NAD-Malic enzyme ；NAD-ME ；EC 1.1.1.38 和 EC 1.1.1.39 )和 NADP-苹果酸酶(NADP-Malicenzyme ;NADP_ME ；EC
1.1.1.40。本发明主要是针对NADP-苹果酸酶)基因进行研究。
[0003]通常认为，NADP-ME为各种细胞组分的合成提供还原力NADPH。例如在产油微生物油脂合成代谢调控中，NADP-ME持续为脂肪酸合成酶进行链延伸提供NADPH (SongY D, Wynn J P, et al, Microbi, 2001，147 (6):1 507-1 515.)。NADP-苹果酸酶在植物的生长代谢及发育过程中也扮演着重要角色，植物中苹果酸酶的底物和产物参与多种代谢途径，包括光合作用和呼吸作用。如热带C4植物中的固碳作用，保持植物细胞的渗透势，稳定细胞质的PH和保持植物根系的离子吸收平衡起重要作用，是生物体生命活动中重要的酶之一(Drincovich M F，Casati P, Andreo C S, FEBS Letters,2001, 490:1-6.4;Martinoia E, Rentsch D, Annual Review of Plant Phys1logy andPlantMolecular B1logy, 1994，45: 447- 467.)。此外，植物 NADP-ME 被认为参与植物防御反应。另有报道表明，NADP-ME参与了果实的成熟，通过苹果酸代谢来平衡细胞内的pH，还通过代谢提供碳源和NADPH调节一些底物及辅助因子来参与脂肪酸的合成。
[0004]NADP-ME也是景天酸代谢途径(CAM)植物的一种重要脱羧酶，酶活性昼高夜低；兼性CAM植物随着C3光合型向CAM型转化，其NADP-ME酶活性涿渐升高，干旱诱导CAM植物其NADP-ME酶活性比C3增加3倍，由此表明:NADP_ME在CAM植物的活性调节中起重要作用。在CAM运行和调节中，NADP-ME和PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)羧化酶一样，具有重要调节作用(王晨，西北植物学报，1997，17 (2): 200-204.)。
[0005]苹果酸酶作为生物体中枢代谢途径的关键酶，也可应用于厌氧混合酸的发酵工程及酿酒工业。因此本发明通过发掘高效、特异性新基因苹果酸酶MI3410ME1，与pET-32a(+)质粒进行重组，并实现在E.coli BL21中表达。为苹果酸酶应用于工业和农业奠定基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种从红冬抱酵母(Rhodosporidium kra tochvilovae)YM25235中分离的苹果酸酶基因欣及该基因编码的氨基酸，或与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1623bp (碱基)，其中1-1623为编码苹果酸酶成熟多肽的开放阅读框；该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0007]本发明的另一目的是提供一种含有苹果酸酶基因欣通57的重组表达载体pET32aRKMEI，该重组表达载体是将SEQ ID NO:1所示基因直接与载体pET32a ( + )所构建的重组表达载体。
[0008]本发明另一目的是提供一种含有上述的苹果酸酶基因欣通57或上述的重组表达载体的宿主表达细胞。
[0009]本发明提供的核苷酸序列SEQ ID NO:1是一种高效、特异性的苹果酸酶基因，将其与表达载体连接后转化至宿主细胞内生产苹果酸酶，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受季节、气候的影响，可以通过利用转化至不同的宿主细胞来开发商业化苹果酸酶等优点。本发明应用基因工程技术构建苹果酸酶重组表达载体pET32a RKME1，将其转化至大肠杆菌生产苹果酸酶，具有操作简单、成本低、可行性高等优点，为苹果酸酶基因工程化生产奠定基础。
【附图说明】
[0010]图1为本发明苹果酸酶基因欣通57构建的大肠杆菌重组表达质粒pET32a RKMEl图谱；
图2为本发明所构建重组表达质粒pET32aRKMEl的酶切分析图:其中:1为DNAMarker ；2为pET32a ( + )酶切后条带；3为pET32aRKMEl酶切后条带；4为苹果酸酶基因RKMEl的PCR扩增产物；
图3为本发明的苹果酸酶基因诱导表达并纯化后的SDS-PAGE分析图:其中:1为转化了 pET32a ( + )并经过IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；2为转化了 pET32aRKMEl并经过IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；3为纯化的目的蛋白条带；4为蛋白电泳Marker。
【具体实施方式】
[0011]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
[0012]实施例1:红冬孢酵母YM25235苹果酸酶基因欣通57的克隆米用 OMEGA 试剂盒 E.Z.N.A Fungal RNA Kit 从红冬抱酵 j^iRhoclosporidiim克ra1cAKiJoKae) YM25235 中提取总 RNA，用反转录试剂盒 Thermo Scientific Maxima HMinus First Strand cDNA Synthesis Kit 合成 cDNA，取 I μ I cDNA 为模板进行聚合酶链式反应；设计引物(引物I和引物2)进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下:引物 1:RKME1-F:5'-CGCGGATCCATGACCTACAACTTCAGCCCC-3' (SEQ ID N0:3)
引物 2:RKME1-R:5'-CCCGAAGCTACTCTTCGTTGAGCAGCGGGT-3' SEQ ID NO:4)
PCR扩增体系(50 μ L)组成如下:
5XFast Pfu Buffer1yL
dNTP (2.5 μπιοΙ/L)5 yL
模板 cDNAIyL
RKMElF (10 ymol/L)IyL RKMElR (10 ymol/L)IyL
Fast Pfu DNA polymerase (5U/ μ L) IyL无菌ddH20补足至50 μ L ;
扩增条件:94°C变性 4min，再用 94°C 40s、53.0°C 40s,72°C lmin30s 进行 30 个循环，最后72°C lOmin，反应完后取产