一种变异种系scn11a基因在制备诊断芯片中的应用
【专利说明】-种变异种系SCN11A基因在制备诊断芯片中的应用
[0001] 本申请是201310070553X号专利申请的分案申请。原申请号为201310070553X ; 原申请日为2013年3月6日；原发明名称为人类周围神经发作性疼痛致病基因及其编码蛋 白。本申请是为克服针对201310070553X号专利申请的第二次审查意见通知书中指出的不 符合单一'性的意见二分案。
技术领域
[0002] 本发明设及一种人体变异的基因，即人类周围神经发作性疼痛致病基因SCN11A。 本发明还设及运种变异基因及其编码的蛋白在检测和作为治疗人类周围神经发作性疼痛 疾病的药物祀点中的作用和意义。
【背景技术】
[0003] 疼痛是在人体受到各种伤害性刺激时所产生的感觉，是存在于人体内部的警戒与 保护系统，它能引起机体产生被动性防御反应W躲避伤害刺激，对机体具有保护作用。但 是过度的伤害性刺激不但会引起强烈的疼痛感觉而且还会导致机体生理功能的素乱，甚 至休克。人类疼痛分为急性疼痛和慢性疼痛，急性痛是人体免受伤害，是组织损伤的生理性 预警信号。然而慢性疼痛是一种病理状态，依据疼痛病理机制，慢性疼痛可分为伤害性或炎 症性疼痛（对疼痛刺激的适当反应）和神经性疼痛（由神经系统损害诱发的不适当反应）。 1994国际疼痛研究会将神经性疼痛（neurogenic pain)定义为"周围或中枢神经系统原发 性或继发性损害或功能障碍或短暂素乱引起的疼痛"。神经性疼痛一直是困扰医学界的难 题，发病机理不是十分清楚。周围神经性痛常设及小直径神经纤维的信号传递，目前发现= 种钢离子通道蛋白化vl. 7、化vl. 8和化vl. 9在周围神经中大量表达，2004年中国医学科 学院北京协和医学院沈岩院±等研究人员从遗传上将化vl. 7钢离子通道蛋白获得性功能 突变与人类疼痛关联起来，随后世界其他研究小组发现30%的小直径神经纤维痛的患者是 由该蛋白获得性功能突变所造成的。2012年10月31号美国耶鲁大学医学院Waxman所领 导的研究团队，在104例先天性神经痛患者中发现7个化vl. 8钢离子通道蛋白的获得性功 能突变，占6. 7%。然而还有许多疼痛患者的致病原因不清楚。
【发明内容】
[0004] 本发明的任务是提供一种变异的SCN11A基因及其编码的蛋白质。
[0005] 本发明的另一个任务是提供检测人类SCN11A基因突变的方法及试剂盒。
[0006] 本发明的又一个任务是提供运种变异的SCN11A基因在制备人类周围神经发作性 疼痛基因诊断忍片中的应用。
[0007] 实现本发明的技术方案是：
[000引本发明提供的变异的SCN11A基因是：
[0009] (1)该变异的SCN11A基因的第673位碱基由野生型的C变异为T，其核巧酸序列 为沈Q ID NO :3所示；
[0010] (2)该变异的SCNllA基因的第2423位碱基由野生型的C变异为G，其核巧酸序列 为沈Q ID NO :5所示。
[0011] 其所编码的蛋白质的氨基酸序列分别为SEQ ID N0:4和6所示（P.R225C、 P.A808G)。该蛋白质可作为治疗人类周围神经发作性疼痛的药物祀点。本发明提供的变异 的人类SCN11A基因可用于制备人类周围神经发作性疼痛基因诊断忍片。
[001引本发明提供的检测人类SCN11A基因突变的试剂盒，含有W下21对引物中的一对 或几对或全部：
[0013] E1-F 5'- CTGGGCTTCTTCTGCTCACTTGT -3' E1-民 5'- GTCCCTCATCCTCATCTTCTCCTC -3'
[0014]
[0015]
[0016] 上述试剂盒还可含有Taq酶、PCR反应缓冲液和/或dNTP。
[0017] 本发明提供的体外检测SCN11A基因第673位碱基突变的试剂盒，含有W下引物 物：
[0018] F:5，CAAGCCCATGCCTTCCCTGT 3，
[0019] R:5'TTGCTTTCAAAGCTCTGAACACCC 3'
[0020] 该试剂盒还可含有化q酶、PCR反应缓冲液、dNTP、限制性内切酶Ben I和/或化nd III。
[002。 本发明提供的体外检测SCN11A基因第2423位碱基突变的试剂盒，含有W下引物 物：
[0022] F:5' ATCCCATTCTGCTTTACCCT 3'
[0023] R:5' CCGCCGTGAGCAAAGGAAC3' 〇
[0024] 该试剂盒还可含有化q酶、PCR反应缓冲液、dNTP、限制性内切酶Ben I和/或化nd III。
[00巧]本发明提供的变异的SCN11A基因，是人类周围神经发作性疼痛致病基因，即发现 了该疾病的基因突变位点，利用该疾病的基因突变位点可检测人体中是否存在该突变的基 因。同时本发明提供周围神经发作性疼痛致病基因编码的蛋白质序列及其突变导致的神经 元动作电位发放次数增高，为阐明该病的致病机制提供了基础，为进一步治疗该病提供了 设计药物的祀点。
[0026] 本发明收集并鉴定了两个周围神经发作性疼痛中国大家系（一个来自吉林通化， 一个来自河北-北京），真对来自吉林通化的疼痛大家系进行微卫星标记全基因组连锁分 析，将运个家系的致病基因定位于3号染色体短臂上即化22. 3-22. 1位点，大约8Mb物理图 距的染色体区段。对来自河北-北京家系连锁分析，该家系的致病基因也连锁在上述区段。
[0027] 本发明选择吉林通化疼痛家系先证者DNA样本，对其进行外显子组测序，在定位 区域内（化22. 3-22. 1)发现SCN11A基因一个点突变；对河北-北京家系患者进行Sanger 测序，发现该基因另一个点突变。上述的两个突变分别在各自家系中所有患者的DM样品 上均得到验证，在家系正常成员、1021例正常汉族人群中不存在上述突变，排除了单个核巧 酸多态性的可能性。同时发现运两个突变造成所编码的氨基酸改变，由此，
[002引本发明提供了 2种如SEQ ID N0:3和5所示变异的人类SCN11A基因，其特征分别 在于，所述SCN11A基因编码区第673位胞喀晚被胸腺喀晚替换（C〉T)、2423位胞喀晚碱基 被鸟嚷岭替换（C〉G)。正常的人类SCN11A基因的核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0029] 本发明提供了 2种如SEQ ID NO :4和6所示变异的人类SCN11A基因所编码的蛋 白质序列，其特征分别在于，SCN11A蛋白的氨基酸序列分别是第225位精氨酸变为半脫氨 酸（P. R225C)、第808位的丙氨酸变为甘氨酸（P. A808G)。正常的人类SCN11A基因所编码 的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0030] 本发明还提供了一种检测来源于人体生物样本中是否存在上述基因突变的方法， 其步骤：
[0031] (1)从待检测样本中提取DM样本材料；
[0032] (2)选取对应引物（见表1)，对所述DNA样本进行聚合酶链扩增（PCR)反应，获取 PCR产物；
[0033] (3)对所述PCR产物进行核巧酸序列测定，与SEQ ID NO : 1序列比对，W确定所述 生物样本中是否含有SCN11A基因突变。
[0034] 优选地，所述生物样本为体液，该体液包括但不限于：血液、血浆、血清、羊水等。
[0035] 优选地，所述体液为血液。
[0036] 优选地，在上述PCR反应中使用的引物对为：SEQIDN0:7和8 ;9和10 ;11和12 ; 13 和 14 ;15 和 16 ;17 和 18 ;19 和 20 ;21 和 22 ;23 和 24 ;25 和 26 ;27 和 28 ;29 和 30 ;31 和 32 ;33 和 34 ;35 和 36 ;37 和 38 ;39 和 40 ;41 和 42 ;43 和 44 ;45 和 46 ;47 和 48 的引物 对扩增相应核巧酸序列。
[0037] 本发明还提供了检测来源人体的生物样本中是否存在上述两种突变的方法，其步 骤包括：
[0038] (1)从所述样本中提取DNA;
[0039] (2)对所述DNA进行聚合酶链扩增（PCR)反应，获取PCR产物；
[0040] (3)对所述PCR产物进行限制性内切酶酶切；
[0041] (4)对所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察和拍照电泳图，与表2 相关酶切产物大小比对，确定所述生物样本中是否含有SCN11A基因上述两种突变。
[0042] 优选地，所述体液为血液或羊水。
[004引优选地，在上述PCR反应中使用的引物对为：SEQ ID NO :49和50间和52
[0044] 优选地，上述PCR产物中使用的2种限制性内切酶Ben I和化nd III。
[0045] 本发明还提供了变异的人类SCN11A基因功能改变，如附图5所示，该基因编码 的蛋白