利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种利用mTERT和mTyr双启动子 联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用。
【背景技术】
[0002] 黑色素瘤（melanoma)是一种常见的皮肤恶性肿瘤，其发病率较低，占恶性肿瘤的 1%~3%，但其恶性度高，转移早且发生广泛，是临床治疗过程中颇为棘手的恶性肿瘤。恶 性黑色素瘤具有快速生长W及高死亡率的特点，黑色素瘤的转移往往发生在肿瘤形成的初 期阶段，且转移性的黑色素瘤侵袭性非常高，传统的治疗方法对其无效或效果很差。由于W 上的种种原因，使得研究者们亟需一种新的研究策略来治疗恶性黑色素瘤。
【发明内容】
[000引本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN 基因构建重组腺病毒的方法及重组腺病毒和应用。将两种启动子对肿瘤细胞的祀向性、HN 基因的细胞调亡作用和腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能 够融合表达上述基因的重组腺病毒，检验HN基因在双启动子的联合调控作用下对B16细胞 的抑瘤作用。为进一步利用重组腺病毒在体内外诱导肿瘤细胞调亡及研制动物肿瘤的广谱 疫苗奠定理论和实验基础。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用mTERT启动子和 mTyr启动子调控HN基因构建重组腺病毒的方法，包括W下步骤： 阳0化]1)从巧7BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和新城疫病毒（NDV) LaSota株感染的鸡胚尿囊液中分别扩增出mTERT启动子基因序列GI:AF157502. UmTyr启 动子基因序列GI:D00439. 1和HN基因序列GI:EF 211815. 1 ;
[0006] 所述的mTERT启动子基因、mTyr启动子基因和HN基因的扩增包括：W mTERTp-F SEQ ID NO :1和mTERTp-R沈Q ID NO :2为引物，W C57化/6小鼠的胸腺DM为模版，扩增 mTERT启动子；WTy巧-F沈Q ID N0:3和Ty巧-R沈Q ID N0:4为引物，W小鼠黑色素瘤 B16细胞总RNA为模版，扩增mTyr启动子；W HN-F沈Q ID NO :5和HN-R沈Q ID NO :6为 引物，W新城疫病毒NDV LaSota株感染的鸡胚尿囊液为模版，扩增HN基因；
[0007] 2)将获得的目的基因克隆到pShuttle-IRES-虹GFP-2穿梭载体中，线性化重组穿 梭载体后与骨架载体pAdeasy-1共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使其在BJ5183内进 行同源重组，构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-mTERTp-Ty巧-HN ;
[0008] 3)将重组腺病毒质粒由化C I酶切后，经脂质体介导转染肥K293细胞，包装获得 重组腺病毒Ad-mTERTp-Ty巧-HN。
[0009] 所述的利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法制备 的重组腺病毒。
[0010] 所述的利用mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因构建重组腺病毒的方法制备 的重组腺病毒在防治小鼠黑色素瘤生物制品方面的应用。
[0011] 本发明的有益效果是：将mTERT启动子对肿瘤细胞的祀向性、mTyr启动子对小 鼠黑色素瘤的组织特异性、HN基因的细胞调亡作用与腺病毒表达载体系统高效稳定表达 外源基因的特性相结合，构建表达上述基因的重组腺病毒Ad-mTERTp-Ty巧-HN，使HN基因 在双启动的联合调控作用下更好的发挥其在抑制肿瘤细胞生长及调亡方面的作用。通过 对重组腺病毒在B16细胞中外源基因的蛋白表达、细胞活力和细胞调亡的检测，综合评价 了重组腺病毒对B16细胞的抑瘤作用，研究结果显示重组腺病毒Ad-mTERTp-Ty巧-HN对 B16细胞生长的抑制作用在第4d达到最大值，对B16细胞的调亡率为58. 39 + 1. 47%，其 余重组腺病毒均可在不同程度上抑制B16细胞的生长并诱导肿瘤细胞调亡，且重组腺病 毒Ad-mTERTp-Ty巧-HN的抑瘤作用（调亡率为58. 39 + 1. 47% )显著优于对照组腺病毒 Ad-GFP(调亡率为19. 05 + 0. 89% ) (P<0. 05)。本发明最终研制出一种针对动物肿瘤性疾病 的广谱疫苗。
【附图说明】
[0012] 图1是mTERTp、mTy巧和HN基因RT-PCR/PCR扩增结果（M:DL250bp DNA分子质量 标准；l:mTERTp基因PCR产物；2:mTy巧基因RT-PCR产物；3:HN基因PCR产物）。 阳01引 图2是腺病毒穿梭载体的PCR扩增结果（M :DL 250bp DNA Marker ;1 :mTERT启 动子片段的PCR扩增产物；2 :mTyr启动子片段的PCR扩增产物；3 :HN基因的PCR扩增产 物；4 :mTERTp-HN基因片段的PCR扩增产物；5 :mTy巧-HN基因片段的PCR扩增产物；6 : mTERTp-mTy巧-HN基因片段的PCR扩增产物）。
[0014] 图3是腺病毒穿梭载体双酶切鉴定结果（M :DL化b DNA Marker ;1 :pShuttle-HN 经化e I和化o I的双酶切产物；2 :p化uttle-mTERTp-HN经Bgl II和化o I的双酶切产 物；3 :pauittle-mTy巧-HN 经 Sea I 和化〇 I 的双酶切产物；4 :pauittle-mTERTp-Ty巧-HN 经Bgl II和化0 I的双酶切产物）。
[0015] 图4是重组腺病毒质粒的电泳结果（M:DL化b DNA Marker ;1:重组腺病毒质粒 pAd-HN ;2 :重组腺病毒质粒pAd-mTERTp-HN ;3 :重组腺病毒质粒pAd-mTy巧-HN ;4 :重组腺 病毒质粒pAd-mTERTp-Ty巧-HN ;5 :重组腺病毒质粒pAd-GFP)。
[0016] 图5是重组腺病毒质粒的化CI酶切鉴定结果（M :DL化b DNA Marker ;1:重 组腺病毒质粒pAd-HN的化C I酶切产物；2 :重组腺病毒质粒pAd-mTERTp-HN的化C I 酶切产物；3 :重组腺病毒质粒pAd-mTy巧-HN的化C I酶切产物；4 :重组腺病毒质粒 pAd-mTERTp-Ty巧-HN的化C I酶切产物；5 :重组腺病毒质粒pAd-GFP的化C I酶切产物）。 阳017]图6是重组腺病毒感染肥K293细胞巧光检测图（10X) (A:正常肥K293 细胞图巧：重组腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染肥K293细胞后24h图；C :重组 腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染肥K293细胞感染后24h巧光图；D :重组腺病毒 Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染肥K293细胞感染后72h图；E :重组腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN 感染肥K293细胞感染后7化巧光图）。
[0018] 图7是是重组腺病毒感染肥K293细胞后经RT-PCR检测HN基因的结果（M:DL 250bp DM Marker ;1 :重组腺病毒Ad-HN ;2 :重组腺病毒Ad-mTERTp-HN ;3 :重组腺病毒 Ad-mTy巧-HN ;4 :重组腺病毒 Ad-mTERTp-Ty巧-HN)。
[0019] 图8是重组腺病毒对B16的细胞毒作用（20 X) (A :正常B16细胞图巧：重组腺病 毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染B16细胞后2地图；C :重组腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染 B16细胞感染后2地巧光图；D :重组腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染B16细胞感染后48h 图；E :重组腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染B16细胞感染后4化巧光图；F :重组腺病毒 Ad-mTERTp-mTy巧-HN感染B16细胞感染后72h图；G :重组腺病毒Ad-mTERTp-mTy巧-HN感 染B16细胞感染后72h巧光图）。
[0020] 图9是Western blotting检测重组腺病毒感染B16细胞后HN蛋白的表达情况。
[0021] 图10是重组腺病毒对B16细胞的细胞活力影响研究。
[0022] 图11是重组腺病毒诱导B16细胞调亡作用研究（A.重组腺病毒Ad-GFP ;B.重组 腺病毒Ad-HN ;C.重组腺病毒Ad-mTERTp-HN ;D.重组腺病毒Ad-mTy巧-HN化重组腺病毒 Ad-mTERTp-Ty巧-HN引起的B16细胞调亡率）（见表5)。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明：
[0024] 随着分子生物学、免疫学、病理学及相关学科的发展，基因治疗现已成为肿瘤学研 究的热点。目前，腺病毒（adenovirus, Ad)载体疗法是基因治疗中最有前景的基因转移方 法之一，它能有效的将外源基