人胎盘间充质干细胞的分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学技术领域，具体是涉及人胎盘间充质干细胞的分离方法。
【背景技术】
[0002]胎盘间充质干细胞具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干细胞研究的一种理想种子细胞。常规分离方法通常难以获得大量纯度较高胎盘间充质干细胞；应用流式细胞仪分选法或磁珠分选法获得的细胞虽然纯度好，但成本很高。胎盘间充质干细胞在胎盘组织的丰度低，想获得一定数量的原代细胞也需要很多的胎盘组织。
[0003]现有技术中，胎盘的细胞成分较复杂，尤其是其中的胎盘间充质干细胞具有多向分化潜能以及抑制淋巴细胞增殖的特性，常规离方法通常难以获得大量且纯度较高的胎盘间充质干细胞。
【发明内容】
[0004]本发明解决的技术问题是针对现有技术存在的缺陷，提供一种人胎盘间充质干细胞的分离方法，可以达到一次操作即可获得大量、较高纯度的人胎盘间充质干细胞的目的。
[0005]本发明解决上述技术问题的技术方案为:
[0006]人胎盘间充质干细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤:
[0007](I)胎盘标本处理，得处理后的胎盘组织；将胎盘组织进行组织消化，用15mmol/L三羟甲基氨基甲烷，加入哈特曼-D溶液，调节pH至8.0，作为消化缓冲液，加入终浓度为2.4g/L HyQTase和300U/mL DNase I组成的消化液，取消化液200mL，将冲洗后的胎盘组织分多次进行消化，每次在37±0.2°C,200r/min恒温气浴摇床消化3min，消化完毕后，220目滤网过滤，收集单细胞，无菌去除HyQTase溶液，用新生牛血清终止消化反应，得到单细胞悬液；
[0008](2)胎盘间充质干细胞的初步传代培养:将步骤(I)的单细胞悬液调整单细胞密度为I X 15个/mL，接种于25mm细胞培养瓶，置于37°C ,5% CO 2浓度的CO 2培养箱中培养，每3天进行换液，细胞生长至培养瓶底面积60 %时，加入HyQTase和300U/mL DNase I组成的消化液消化4min，加等体积新生牛血清终止消化，用D-Hank’ s液稀释5倍后，室温下100g离心12min，弃上清，吹打混匀；
[0009](3)胎盘间充质干细胞的进一步分离与培养:用含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、丙酮酸盐、10毫克/升亚砸酸钠胰岛素、2毫克/升乙醇胺和20毫微克/mL的bFGF、增殖促进剂配制成悬浮液，所述增殖促进剂为凝结的脐带血液的液体成分，将步骤(2)获得的胎盘间充质干细胞进行重悬，在微重力环境下，依次通过电磁场和声波处理间充质干细胞，计数并接种于75mm的培养瓶，在培养基中补充4mg/ml碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml N-乙酰基-L-半胱氨酸、100ng/ml氯化钙，放入37°C、二氧化碳浓度为0.5%的C02培养箱中培养，2d换液I次，细胞生长至90%融合后，消化并计数细胞，细胞传代后生长速度较快，细胞形态比较均一，变化形态明显的第2天用100ng/ml的BMP4处理，第3天或4用10ng/ml的BMP4处理，第5天用lng/ml的BMP4处理，到第6天时，用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加无血清培养基继续培养，待培养8?9天时细胞开始出现老化现象，此时需要注入一种抗氧化剂，所述抗氧化剂为聚乙二醇-缀合过氧化氢酶或N-乙酰半胱氨酸，或使用抗氧化物，所述抗氧化物为1-500 μ M丙酮酸乙酯(EP)，抑制间充质干细胞的衰老，用于增加干细胞产量，待培养10?13天后即可获得人胎盘间充质干细胞原代细胞。
[0010]进一步地，在上述方案中，所述的胎盘标本处理步骤包括:无菌条件下取足月生产的胎盘组织，剪取小块胎儿蜕膜侧胎盘组织剪碎，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的保存液是将50微克/毫升多聚赖氨酸加入到50微克/毫升没食子酸酯EGCG中配制而成，浸泡预定时间后，用生理盐水反复冲洗血污，直至冲洗液接近无色。
[0011]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0012](I)采用HyQTase和DNAse I共同消化，分离出胎盘间充质干细胞，在连续传代培养过程中该细胞形态始终保持一致，未发现分化细胞形态出现；再将初步培养后获得的胎盘间充质干细胞用差速贴壁法将未贴壁的上层除掉，然后向培养瓶中补加无血清培养基继续培养，最终纯度很高。
[0013](2)本方法成功地从胎盘组织中分离到胎盘间充质干细胞，并通过对其连续传代过程中的遗传稳定性，以及细胞表面分子表达情况，细胞形态检测等验证了该细胞的干细胞特性，从而建立了较完善的细胞分离培养及鉴定的体系，为进一步研究胎盘间充质干细胞的生物学和免疫学特性、分化能力，以及将其作为临床应用的种子细胞等提供了材料。
【附图说明】
[0014]图1为本发明实施例中胎盘间充质干细胞的形态鉴定图，A:原代胎盘间充质干细胞(x200)，B:第十八代胎盘间充质干细胞图(x200):
[0015]图2为本发明实施例中流式细胞仪对胎盘间充质干细胞特异性表面抗原的鉴定图，A:阴性对照，B:CD29检测结果，C:CD44检测结果，D:CD105检测结果；
[0016]图3为本发明实施例中胎盘间充质细胞染色体核型分析图，A:第二代细胞染色体核型x400 ；B:第十八代细胞染色体核型x400。
【具体实施方式】
[0017]人胎盘间充质干细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤:
[0018](I)胎盘标本处理，无菌条件下取足月生产的胎盘组织，剪取小块胎儿蜕膜侧胎盘组织剪碎，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的保存液是将50微克/毫升多聚赖氨酸加入到50微克/毫升没食子酸酯EGCG中配制而成，浸泡预定时间后，用生理盐水反复冲洗血污，直至冲洗液接近无色，得处理后的胎盘组织；将胎盘组织进行组织消化，用15mmol/L三羟甲基氨基甲烷，加入哈特曼-D溶液，调节pH至8.0，作为消化缓冲液，加入终浓度为2.4g/L HyQTase和300U/mL DNase I组成的消化液，取消化液200mL，将冲洗后的胎盘组织分多次进行消化，每次在37±0.2°C、200r/min恒温气浴摇床消化3min，消化完毕后，220目滤网过滤，收集单细胞，无菌去除HyQTase溶液，用新生牛血清终止消化反应，得到单细胞悬液；
[0019](2)胎盘间充质干细胞的初步传代培养:将步骤(I)的单细胞悬液调整单细胞密度为I X 15个/mL，接种于25mm细胞培养瓶，置于37°C ,5% CO 2浓度的CO 2培养箱中培养，每3天进行换液，细胞生长至培养瓶底面积60 %时，加入HyQTase和300U/mL DNase I组成的消化液消化4min，加等体积新生牛血清终止消化，用D-Hank’ s液稀释5倍后，室温下100g离心12min，弃上清，吹打混匀；
[0