一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法及应用，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002]间苯三酚是一种重要的精细化工产品，是合成黄酮、异黄酮类药物的中间体，间苯三酚本身可作为一种优良的平滑肌解痉药物，广泛应用于临床。间苯三酚还能抑制过氧化物酶活性，具有抗炎抗氧化作用，它可催化H2O2分解为分子氧和水，是一种重要的抗氧化酶。此外，间苯三酚还是一种性能优越的抗养护剂、稳定剂、燃料偶合剂、轮胎增粘剂等，具有广阔的市场需求。目前，间苯三酚的工业化生产方法主要为化学合成法，包括三硝基甲苯(TNT)法、异丙基苯法、氯代苯法和苯胺法。化学合成法存在多种弊端，如原料来源困难、副产物较多、分离提纯困难、环境污染严重等。以微生物发酵生产间苯三酚，可以克服化学法的多种弊端，并且生物法合成间苯三酚周期短，安全环保。
[0003]异源表达焚光假单胞菌聚酮合成酶基因phlD可以合成间苯三酸(JihaneAchkar, Mo Xian, Huimin Zhao, J.ff.Frost.B1synthesis of phloroglucinol[J].Journalof the American Chemical Society, 2005, 127(15):5332-5333.；ffenjuan Zha, SherylB.Rubin-Pitel, Huimin Zha0.Characterizat1n of the substrate specificity ofPhlD, a type III polyketide synthase from Pseudomonas fluorescens[J].Journalof B1logical Chemistry, 2006，281 (42):32036-32047.)。在此基础上表达多重抗性激活因子marA，增强大肠杆菌对间苯三酚的耐受性，表达大肠杆菌自身的乙酰CoA羧化酶基因(Accase)，细胞内丙二酸单酰CoA的水平为原始菌株的3.6倍(Yujin Cao, XinglinJiang, Rubing Zhang, Mo Xian.1mproved phloroglucinol product1n by metabolicallyengineered Escherichia coli[J].Appl Microb1l B1technol,2011，91:1545 - 1552.)。然而，间苯三酚目前的产量、产率仍然偏低，难以满足工业生产的需求。需要进一步对工程菌株进行基因改造，以期提高间苯三酚的合成能力。
[0004]大肠杆菌的代谢网络包含数百种代谢物，这些代谢物通过大量的生化和调节反应相互关联。代谢流的调控可在转录水平，转录后水平，酶活动力学等不同水平通过多种复杂机制实现。转录水平的调控是大肠杆菌最重要的调节模式。iclR是大肠杆菌的一种局部调控因子，能够抑制aceBAK操作子的表达。aceBAK操作子主要负责编码乙醛酸循环的相关酶，异柠檬酸裂解酶、苹果酸合酶和异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸化酶(Hendrik ffaegeman, Stijn De Lausnay, Joeri Beauprez, Jo Maer tens, Marjan De Meyand Wim Soetaert.1ncreasing recombinant protein product1n in Escherichia coliK12through metabolic engineering.New B1technology.2013，2 (30): 255-261.)。敲除iclR能够提高乙醛酸循环的活性，促进乙酸的利用。乙酰辅酶A合成酶(ACS)是细胞内同化乙酸的主要途径，ACS通过两步酶促反应催化乙酸合成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A经过乙醛酸循环和TCA循环，提供细胞合成的前体物质和能量。研宄表明，过表达acs能够促进乙酸同化，降低乙酸的积累(Lin H, Castro NM, Bennett GN, San KY:Acetyl-CoA synthetaseoverexpress1n in Escherichia coli demonstrates more efficient acetateassimilat1n and lower acetate accumulat1n:a potential tool in metabolicengineering.Appl Microb1l B1technol 2006，71 (6):870-874.)。
[0005]过表达phlD、Accase等基因可提高间苯三酚产量，但目前间苯三酚的产量和产率仍无法满足工业生产的需求。iclR是大肠杆菌内重要的转录调控因子，敲除iclR能够显著提高乙醛酸循环的活性。过表达acs能够促进乙酸转化为乙酰辅酶A，提高乙酸的同化能力。敲除调控因子iclR同时过表达acs的基因改造方法对间苯三酚发酵生产的影响暂无报道，通过活化乙醛酸循环，促进乙酸同化提高间苯三酚产量的基因改造方法也无报道。
【发明内容】
[0006]为解决上述问题，本发明提供了一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法，所采取的技术方案如下:
[0007]本发明的一个目的在于提供一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法，该方法是敲除出发菌株的转录控制因子iclR基因获得突变菌株，再将突变菌株转为感受态后导入含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因Accase、乙酰辅酶A合成酶基因acs的重组质粒，获得重组细胞。
[0008]所述方法的步骤如下:
[0009]I)利用Pl噬菌体侵染供体菌，制备噬菌体的溶菌产物，再利用所得溶菌产物侵染出发菌，获得侵染菌株；
[0010]2)制备步骤I)所得侵染菌株的感受态细胞，并导入质粒PCP20，敲除卡那霉素抗性基因，获得突变菌株；
[0011]3)制备含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因Accase、乙酰辅酶A合成酶基因acs的重组质粒；
[0012]4)制备步骤2)所得突变菌株的感受态细胞，并导入步骤3)所得的重组质粒，获得重组菌。
[0013]优选地，步骤I)所述供体菌，是大肠杆菌E.coli BW25113iclR:Kan。
[0014]优选地，步骤I)所述出发菌，是大肠杆菌。更优选地，所述大肠杆菌，是大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
[0015]优选地，步骤3)所述聚酮合成酶基因phlD，来源于焚光假单胞菌Pseudomonasfluorescens, Genebank ID: 11830552 ;所述多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌Escherichia coli,Genebank ID:6060688 ;所述乙醜 CoA 幾化酶基因 Accase 四个亚基，来源于大肠杆菌 Escherichia coli, accA 的 Genebank ID:6062185, accB 的 Genebank ID:6058890，accC 的 Genebank ID:6058863, accD 的 Genebank ID:6059083 ;乙酰辅酶 A 合成酶 acs，来源于大肠杆菌 Escherichia coli, Genebank ID:948572。
[0016]所述方法的具体步骤如下:
[0017]I)利用Pl噬菌体侵染大肠杆菌E.coli BW25113iclR:Kan,制备噬菌体的溶菌产物，再利用所得溶菌产物侵染大肠杆菌E.coliBL21 (DE3)，获得侵染菌株E.coli (DE3)iclR:Kan ；
[0018]2)制备步骤I)所得侵染菌株的感受态细胞，并导入质粒pcp20，消除卡那霉素抗性基因，获得突变菌株E.coli(DE3) AiclR;
[0019]3)将聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰辅酶A合成酶基因acs连接到载体pET30a上，获得重组质粒pET-phlD-marA-acs ；乙酰CoA羧化酶基因Accase连接到载体PACYC上，获得重组质粒pACYC-accADBC ;所述聚酮合成酶基因phlD，来源于焚光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens, Genebank ID:11830552 ;所述多重抗性激活因子 marA，来源于大肠杆菌 Escherichia coli, Genebank ID:6060688 ;所述乙醜 CoA 幾化酶基因Accase四个亚基，来源于大肠杆菌Escherichia coli, accA的Genebank ID:6062185，accB 的 Genebank ID:6058890，accC 的 Genebank ID:6058863，accD 的 GenebankID:6059083 ;乙醜辅酶 A 合成酶 acs，来源于大肠杆菌 Escherichia coli, Genebank ID:948572 ；
[0020]4)制备步骤2)所得突变菌株E.coli (DE3) Δ iclR的感受态细胞，并将步骤3)所得的重组质粒 pET-phlD-marA-acs 和 pACYC-accADBC 导入到突变菌株E.coli (DE3) Δ iclR的感受态细胞中，获得重组菌。
[0021]所述任一方法用于获得高产间苯三酚的基因工程菌和生产间苯三酚。
[0022]本发明的另一目的在于提供了一种利用所述方法生产间苯三酚的方法，该方法的步骤如下:
[0023]I)利用Pl噬菌体侵染大肠杆菌E.coli BW25113iclR:Kan,制备噬菌体的溶菌产物，再利用所得溶菌产物侵染大肠杆菌E.coliBL21 (DE3)，获得侵染菌株E.coli (DE3)iclR:Kan ；
[0024]2)制备步骤I)所得侵染菌株的感受态细胞，并导入质粒pcp20，消除卡那霉素抗性基因，获得突变菌株E.coli(DE3) AiclR;
[0025]3)将聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰辅酶A合成酶基因acs连接到载体pET30a上，获得重组质粒pET-phlD-marA-acs ；乙酰CoA羧化酶基因Accase连接到载体PACYC上，获得重组质粒pACYC-accADBC ;所述聚酮合成酶基因phlD，来源于焚光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens, Genebank ID:11830552 ;所述多重抗性激活因子 marA，来源于大肠杆菌 Escherichia coli, Genebank I