喹啉或异喹啉类小分子化合物在人多能干细胞培养及冷冻保存中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及嗟咐或异嗟咐类小分子化合物在人多能干细胞培养及冷冻保存中的 应用及实施方法。
【背景技术】
[0002] 胚胎干细胞巧SCs)来源于胚胎囊胚的内细胞团，具有无限的增殖能力和多向分 化潜能。1998年，美国Wisconsin大学的Tomson等（Tomsonetal.，1998)首次从人工体 外受精的囊胚内细胞团分离得到人胚胎干细胞，并成功进行体外培养建系。因其可在体外 无限繁殖，并能分化成=个胚层来源的各种细胞类型，故人胚胎干细胞成为再生医学、组织 工程、药物筛选、发育生物学研亢等领域的研亢热点仰igushiandSasai，2011)。由于人胚 胎干细胞建立设及伦理道德和法律等问题，其研亢与应用受到很大限制。日本学者化inya Yamanaka在2006年和2007年，通过导入四个转录因子（0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc)，首 次分别将小鼠和人的皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（Tak址ashiandYamanaka， 2006;Tak址ashietal. ,2007)，并因此贡献获得了 2012年的诺贝尔生理学或医学奖。此 后，不同的研亢组分别使用修饰的方法获得了诱导多能干细胞。诱导多能干细胞与胚胎干 细胞同为多能干细胞，具有与胚胎干细胞相同的体外无限扩增和分化能力，并且不存在伦 理道德和法律等的问题，因此在再生医学和组织工程领域具有广阔的应用前景和巨大的经 济价值。另一方面，可根据需要从患者来源的细胞获得诱导多能干细胞，该为将来的个体化 治疗带来了希望。
[0003] 人多能干细胞最初的培养条件由生长在明胶等基底包被的细胞培养器皿中，并由 鼠胚胎成纤维细胞或其它成纤维细胞等饲养层细胞支持，同时还需要敲除血清替代品作为 主要的培养基添加剂。含饲养层的培养方法相对比较繁琐，价格昂贵，而且生长环境中含 有动物源成分，有可能引起免疫排斥反应或者引入病毒，该对严重限制了基础研亢及其临 床应用。研亢者们开始探讨开发无饲养层的人多能干细胞培养方法，关于人多能干细胞无 饲养层培养的方法的报道越来越多。包含细胞粘附分子，如层粘连蛋白、玻连蛋白和纤连 蛋白等的基质胶被证明可W提高无饲养层培养条件下人多能干细胞的存活和克隆形成。 Matrigel，是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取的基质胶，目前在人多能干细胞 研亢中被广泛应用。无饲养层细胞的培养方式给人多能干细胞的研亢及应用带来了极大的 便利，将逐渐代替饲养层的培养方式。然而相对于含饲养层的培养方式，用无饲养层的培养 方式获得人多能干细胞要困难的多，细胞的存活率和克隆形成率很低。因此，改进无饲养层 的培养条件W促进人多能干细胞存活和克隆形成是未来的一个重要的研亢方向。
[0004] 为了实现多能干细胞的应用，必需对其进行体外扩增W获得大量的细胞源，并实 现高效冷冻保存。然而，人多能干细胞在培养操作过程中极易发生大量的细胞死亡，该成为 其体外扩增、基础研亢和临床应用的巨大障碍。细胞体外扩增和冷冻保存过程设及细胞解 离、冷冻保护剂移入、超低温冷冻保存、快速复苏、冷冻保护剂移出等步骤。但是，解离成单 细胞的人多能干细胞极易发生大量的细胞调亡的hgushietal.，2010)，W致无法进行后 续操作。另外，超低温慢速冷冻后虽然人胚胎干细胞的细胞膜能够维持其完整性，但细胞 的功能却受到损害，大量细胞在复苏过程发生细胞调亡，从而导致极低的复苏率化enget al. ,2006)。针对该些问题，目前国内外很多研亢者正试图通过改变细胞解离方法、改进低 温冷冻方法、筛选新型冷冻保护剂和研亢细胞调亡机理等方面寻找稳定、可靠的人多能干 细胞培养和保存技术，为科学研亢及临床应用提供保障。虽然该些工作取得了一定的进展， 但是至今仍然没有一个简单可靠、价格低廉、重复性强的提高人多能干细胞成活率的培养 及冷冻保存方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了嗟咐或异嗟咐类小分子化合物在人多能干细胞培养及冷冻保存中 的应用及实施方法，可显著促进人多能干细胞存活和克隆形成，并且保持多能干细胞的未 分化状态和多能性。
[0006] 本发明方法中人多能干细胞包括人胚胎干细胞或者利用生物技术手段获得的人 诱导多能干细胞。
[0007] 人多能干细胞在解离成单细胞传代时存活率极低，本发明的特征之一是通过在解 离前后培养基中添加适当浓度的嗟咐或异嗟咐类小分子化合物，可显著提高解离成单细胞 的人多能干细胞的存活和克隆形成。其浓度可W在1-100 的范围。
[000引人多能干细胞W单细胞形式进行冻存，复苏后细胞存活率极低，本发明的特征之 一是通过在冻存液、复苏液或者培养基中添加适当浓度的嗟咐或异嗟咐类小分子化合物， 可显著提高冷冻保存的人多能干细胞存活和克隆形成。其浓度可W在1-100uM的范围。
[0009] 本发明方法适用于人多能干细胞的含饲养层和无饲养层细胞的培养方式。
[0010] 对于含饲养层细胞的培养方式，饲养层细胞生长在基质胶包被的细胞培养器皿 中，基质胶可W为明胶或者其它任何支持饲养层细胞生长的基质胶。饲养层细胞为可W为 采用福照或者丝裂霉素C等化学品处理过的不具备分裂能力的任何支持人多能干细胞生 长的细胞类型。
[0011] 对于无饲养层细胞的培养方式，细胞培养器皿需要用基质胶包被，基质胶可W为Matrigel或者其它任何支持人多能干细胞生长的商业化或者自制基质胶。
[0012] 本发明方法除适用于单细胞形式的人多能干细胞，对于解离成小细胞团块形式的 人多能干细胞，在培养或者冻存复苏后，嗟咐或异嗟咐类小分子化合物具有相似的促进作 用。解离人多能干细胞的溶液可W为膜酶、TrypLE、分散酶、胶原酶或者邸TA等。
[0013] 本发明提供一种人多能干细胞冻存液，利用该冻存液冻存的人多能干细胞具有很 好的存活率和克隆形成效率。该冻存液可W为添加适当浓度嗟咐或异嗟咐类小分子化合物 的商业化的冻存液，或者自制冻存液。
[0014] 本发明提供一种人多能干细胞复苏液，利用该复苏液复苏后的人多能干细胞具有 很好的存活率和克隆形成效率。该复苏液可W为添加适当浓度嗟咐或异嗟咐类小分子化合 物的DMEM、DMEM/F12、KnockoutDMEM或者KnockoutDMEM/F12 等基础培养基，或者W该几 种基础培养基配制的支持人多能干细胞生长的商业化或者自制培养基，或者其它商业化或 者自制复苏液。
[0015] 本发明方法适用于人多能干细胞的慢速冻存法和玻璃化冻存法。对于慢速冻存 法，设及利用程序控温仪W1-10°C/min的冻存速率进行冻存的方法，或者利用商业化的冻 存盒的冻存方法，或者其它常用的梯度降温冻存法；对于玻璃化冻存法，设及利用麦管或者 其它改进装置的玻璃化冻存法。
[0016] 本发明方法通过在人多能干细胞培养或者冷冻保存过程中，简单的添加适当浓度 的嗟咐或异嗟咐类小分子化合物即可显著提高解离或者冷冻复苏后的细胞存活和克隆形 成，并且仍然维持人多能干细胞的未分化状态和多能性。该方法操作非常简便，并且价格低 廉、效果明显，可W稳定获得大量的细胞，W满足基础研亢和临床应用的需求，应用前景广 阔。
【附图说明】
[0017] 图1为含饲养层培养的人胚胎干细胞克隆形成及其形态
[0018] 图2为无饲养层培养的人胚胎干细胞克隆形成及其形态
[0019] 图3为人胚胎干细胞解离成单细胞培养时细胞存活情况
[0020] 图4为W单细胞形式冻存的人胚胎干细胞复苏后细胞相对存活率
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