破囊壶菌、脂肪酸组合物和其制备方法及用图
【专利说明】破囊壶菌、脂肋酸组合物和其制备方法及用途
[0001] 本发明申请是基于申请日为2009年3月19日、申请号为200980159422. 0(国际 申请号为PCT/US2009/001720)、名称为"破囊壶菌、脂肪酸组合物和其制备方法及用途"的 发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及分离的破囊壶菌（t虹austochytrid)微生物及其菌株和变体。本发明 还设及破囊壶菌生物质、微生物油、组合物、培养物、生产微生物油的方法和使用分离破囊 壶菌、生物质及微生物油的方法。
【背景技术】
[0003] 脂肪酸基于碳链长度和饱和特性分类。短链脂肪酸通常具有12个碳或更少，中链 脂肪酸通常具有14到18个碳，长链脂肪酸通常具有20个或更多碳。碳原子间不存在双键 时脂肪酸定义为饱和脂肪酸且在双键存在时定义为不饱和脂肪酸。仅存在一个双键时不饱 和长链脂肪酸是单不饱和且存在大于一个双键时是多不饱和。
[0004] 多不饱和脂肪酸（PUFA)基于所述脂肪酸甲基末端的第一个双键位置分类。 Q-3 (n-3)脂肪酸在第=个碳上包含第一个双键，而Q-6 (n-6)脂肪酸在第六个碳上包含 第一个双键。例如，二十二碳六締酸广DHA")是Q-3长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA)，具有 22个碳的链长度和6个双键，通常标为"22:6n-3"。其他Q-3LC-PUFA包括标为"20:5 n-3"的二十碳五締酸（"EPA")和标为"22:5n-3"的Q-3二十二碳五締酸广DPAn-3")。 DHA和EPA定义为"必需"脂肪酸。Q-6LC-PUFA包括标为"20:4n-6"的花生四締酸广ARA") 和标为"22:5n-6"的Q-6二十二碳五締酸广DPAn-6")。
[0005] Q-3脂肪酸是生物学上重要的分子，由于其在细胞膜的存在而影响细胞生理 学，调节生物活性化合物的生成和基因表达，且用作生物合成底物。Roche,H.M.，Proc. Nutr.Soc.58:397-401(1999)。例如，DHA占人大脑皮层中脂质的约15% -20 %、视网膜 中脂质的约30% -60%，其集中于睾丸和精液中，且是乳汁中的重要成分。Jean-Pascal Berg6和GillesBarnathan，"来自海洋生物脂质的脂肪酸；分子生物多样性，作为生 物标记的作用，生物活性化合物和经济方面"（FattyAcids化omLipidsofMarine Organisms:MolecularBiodiversity,RolesasBiomarkers,BiologicallyActive Compounds,andEconomicalAspects),《海洋生物技术》（MarineBiotechnology)]；49(T. Sch巧er编，2005)。DHA占大脑中Q-3脂肪酸的多达97%和视网膜中Q-3脂肪酸的多 达93%。此外，DHA对胎儿和婴儿发育化及维持成人中的认知功能是必需的。同上。包括 DHA和EPA在内的Q-3脂肪酸也具有抗炎特性。参见例如同上W及Simopoulos，A.P.，J. Am.Coll.Nutr.21:495-595(2002)。由于Q-3脂肪酸不在人体内从头合成，该些脂肪酸必 须获得自营养源。
[0006] 亚麻巧油和鱼油被视作Q-3脂肪酸的良好膳食来源。亚麻巧油不含EPA、DHA、DPA 或ARA，但含有能使身体生成EPA的基础成分亚麻酸（C18:3n-3)。然而，有证据显示代谢 转化率可w较慢且可变，特别是在健康受损的机体中。鱼油在脂肪酸组成的类型和水平上 差异很大，该取决于具体物种和其饮食。例如，水产养殖的鱼往往Q-3脂肪酸水平低于野 生鱼。此外，鱼油具有含环境污染物的风险并可能设及稳定性问题和鱼腥味或口味。
[0007] 破囊壶菌是破囊壶菌目（T虹austochyhiales)微生物。破囊壶菌包括裂殖壶 菌属（Schizochytrium)的成员且被认为是包括DHA在内的Q-3脂肪酸的替代来源。参 见美国专利第5, 130, 242号。该些海洋异养微生物生成的油通常具有比相应鱼或微藻油 更简单的多不饱和脂肪酸分布。Lewis,T.E. ,Mar.Biotechnol. 1:580-587 (1999)。据报 道，破囊壶菌菌株W该生物体所产生总脂肪酸的高百分比生成Q-3脂肪酸。美国专利第 5, 130, 242 号；Huang,J.等，J.Am.Oil.Qiem.Soc. 78:605-610(2001) ;Huang,J.等，Mar. Biotechnol. 5:450-457 (2003)。然而，分离的破囊壶菌在生成LC-PUFA的特性和量上不同， 从而一些前述菌株可能具有的n-6脂肪酸水平不理想和/或在培养中表现出低生产率。由 此，从营养源中分离出证明有高生产率和理想LC-PUFA分布的破囊壶菌的需求一直存在。
【发明内容】
[0008] 本发明设及WATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌物种的分离破囊壶菌微生物 或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的 二十碳五締酸。
[0009] 本发明也设及具有WATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌物种特征的分离破 囊壶菌微生物，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的 二十碳五締酸。
[0010] 本发明也设及含有甘油=醋组分的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所 述甘油=醋组分的二十二碳六締酸含量为至少约40重量％，其中所述甘油=醋组分的 二十二碳五締酸n-6含量为至少约0. 5重量％ -约6重量％，且其中所述微生物或其衍生 菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五締酸。
[0011] 本发明也设及与WATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌物种同种的分离破囊壶 菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％ 或更少的二十碳五締酸。
[0012] 在一些实施方式中，本发明衍生自分离破囊壶菌微生物的菌株是突变菌株。
[0013] 本发明也设及WATCC登录号PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697 或PTA-9698 保藏的 分离微生物。
[0014] 本发明也设及含任意一种本发明破囊壶菌微生物或其混合物的破囊壶菌生物质。
[0015] 本发明也设及分离的破囊壶菌生物质，其中至少约50重量％的生物质细胞干重 是脂肪酸，且其中至少约50重量％的脂肪酸是Q-3脂肪酸。在一些实施方式中，至少约50 重量％的脂肪酸是二十二碳六締酸。本发明还设及分离的破囊壶菌生物质，其中至少约25 重量％的生物质细胞干重是二十二碳六締酸。
[0016] 在一些实施方式中，本发明也设及分离的破囊壶菌生物质，其中约10重量％或更 少的脂肪酸是二十碳五締酸，且其中二十二碳六締酸与二十碳五締酸的重量比为至少约 5:1。
[0017] 在一些实施方式中，本发明也设及分离的破囊壶菌生物质，其中约1.5重量％ 或更少的脂肪酸是花生四締酸，且其中二十二碳六締酸与花生四締酸的重量比为至少约 20:1。
[0018] 在一些实施方式中，本发明也设及分离的破囊壶菌生物质，其含有的二十二碳六 締酸与二十二碳五締酸n-6的重量比为至少约10:1。
[0019] 本发明也设及含任意一种本发明破囊壶菌微生物或其混合物的分离破囊壶菌培 养物。在一些实施方式中，所述培养物包括至少约5%的溶解氧。
[0020] 本发明也设及用于动物或人的食品、化妆品或药物组合物，其包含本发明破囊壶 菌微生物或生物质中的任何一种或其混合物。
[0021] 本发明也设及含有至少约70重量％甘油S醋组分的微生物油，其中所述甘油S 醋组分的二十二碳六締酸含量为至少约50重量％，其中所述甘油S醋组分的二十二碳五 締酸n-6含量为约0. 5重量％ -约6重量％。在一些实施方式中，所述微生物油还包括占 所述甘油S醋组分约1. 5重量％或更少的花生四締酸含量。
[0022] 本发明也设及含有至少约70重量％甘油S醋组分的微生物油，其中所述甘油S 醋组分的二十二碳六締酸含量为至少约40重量％，其中所述甘油S醋组分的二十二碳五 締酸n-6含量为至少约0. 5重量％ -约6重量％，且其中二十二碳六締酸与二十二碳五締 酸n-6的比例为大于约6:1。
[0023] 本发明也设及含有至少约70重量％甘油S醋组分的微生物油，其中所述甘油S 醋组分的二十二碳六締酸含量为至少约60重量％。
[0024] 在一些实施方式中，所述微生物油甘油S醋组分的至少约20%甘油S醋在所述甘 油=醋内的两个位置上含有二十二碳六締酸，所述位置选自sn-1、sn-2和sn-3位置中的任 意两个。在一些实施方式中，所述微生物油甘油=醋组分的至少约5%甘油=醋在所述甘油 S醋中sn-1、sn-2和sn-3S个位置都含有二十二碳六締酸。
[00巧]在一些实施方式中，所述微生物油还包括约5重量％或更少的十走酸。
[0026] 本发明也设及用于动物或人的食品、化妆品或药物组合物，其包含本发明的任何 微生物油。在一些实施方式中，所述食品是婴儿配方。在一些实施方式中，所述婴儿配方适 合早产儿。在一些实施方式中，所述食品是牛奶、饮料、治疗性饮品、营养素饮料或其组合。 在一些实施方式中，所述食品是用于动物或人食物的添加剂。在一些实施方式中，所述食品 是营养补充品。在一些实施方式中，所述食品是动物饲料。在一些实施方式中，所述动物饲 料是水产养殖饲料。在一些实施方式中，所述动物饲料是牲畜饲料、动物园动物饲料、役畜 饲料、家畜饲料或其组合。
[0027] 本发明也设及含Q-3脂肪酸的微生物油的生产方法，该方法包括；(a)使本发明 的任何一种分离破囊壶菌微生物或其混合物在培养物中生长W生成生物质，和化）从所述 生物质中提取含Q-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，所述培养物包括至少约5%的溶解 氧。在一些实施方式中，所述培养物抑维持在约6. 5-约8. 5。在一些实施方式中，所述培 养物温度维持在约17°C-约30°C。在一些实施方式中，所述培养物包括约5g/l-约50g/L 浓度的葡萄糖。
[0028] 本发明也设及含Q-3脂肪酸的微生物油的生产方法，该方法包括从本发明任何 一种生物质中提取含Q-3脂肪酸的油。在一些实施方式中，所述微生物油用己烧提取方法 提取。在一些实施方式中，微生物油用无溶剂提取方法提取。
[0029] 在一些实施方式中，在pH约6. 5-约8. 0的培养基中约17°C-约30°C生长7天后， 从每升本发明任何培养物中分离的生物质干细胞重为至少约50g，所述培养基包含碳、氮和 营养源及约95化pm-约8500ppm氯离子。
[0030] 在一些实施方式中，在抑约6. 5-约8. 0的培养基中约17°C-约30°C生长7天后， 本发明的任何一种分离培养物的n-3脂肪酸生产率为至少约2克/升/天，所述培养基包 含碳源、氮源和营养素及约95化pm-约8500ppm氯离子。
[0031] 本发明也设及通过本发明方法产生的微生物油。
[0032] 本发明也设及采用本发明的任何分离微生物、生物质或微生物油或其混合物生产 治疗炎症或其相关病症的药物。
[0033] 本发明也设及采用本发明的任何分离微生物、生物质或微生物油或其混合物治疗 炎症或其相关病症。
[0034] 本发明也设及用于治疗炎症或其相关病症的本发明的任何分离微生物、生物质或 微生物油或其混合物。
[0035] 本发明也设及在需要的对象中治疗炎症或其相关病症的方法，包括将本发明的任 何分离微生物、生物质或微生物油或其混合物W及药学上可接受载体给予对象。
[0036] 具体地，本发明设及如下各项：
[0037] 1. -种WATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌的分离破囊壶菌微生物或其衍生 菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五 締酸。
[0038] 2. -种具有WATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌特征的分离破囊壶菌微生 物，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五締 酸。
[0039] 3. -种含有甘油=醋组分的分离破囊壶菌微生物或其衍生菌株，其中所述甘油= 醋组分的二十二碳六締酸含量为至少约40重量％，其中所述甘油S醋组分的二十二碳五 締酸n-6含量为至少约0. 5重量％ -约6重量％，且其中所述微生物或其衍生菌株生成的 总脂肪酸包括约10重量％或更少的二十碳五締酸。
[0040] 4. 一种与WATCC登录号PTA-9695保藏的破囊壶菌同种的分离破囊壶菌微生物 或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的总脂肪酸包括约10重量％或更少的 二十碳五締酸。
[0041] 5.如项1到4中任一项所述的分离破囊壶菌微生物，其特征在于，所述衍生菌株是 突变菌株。
[0042] 6. -种WATCC登录号PTA-9695保藏的分离的破囊壶菌微生物。
[0043] 7. -种WATCC登录号PTA-9696保藏的分离的破囊壶菌微生物。
[0044] 8. -种WATCC登录号PTA-9697保藏的分离的破囊壶菌微生物。
[0045] 9. 一种WATCC登录号PTA-9698保藏的分离的破囊壶菌微生物。
[0046] 10. -种含有前述项中任一项所述的破囊壶菌微生物或其混合物的破囊壶菌生物 质。
[0047] 11. -种分离的破囊壶菌生物质，其中，至少约50重量％的所述生物质的细胞干 重是脂肪酸，且其中至少约50重量％的脂肪酸是Q-3脂肪酸。
[0048] 12.如项11所述的分离破囊壶菌生物质，其特征在于，所述至少约50重量％的所 述脂肪酸是二十二碳六締酸。
[0049] 13. -种分离的破囊壶菌生物质，其中，至少约25重量％的所述生物质的细胞干 重是二十二碳六締酸。
[0050] 14.如项10到13中任一项所述的分离破囊壶菌生物质，其特征在于，约10重量％ 或更少的所述脂肪酸是二十碳五締酸，且其中二十二碳六締酸与二十碳五締酸的重量比为 至少约5:1。
[0051] 15.如项10到14中任一项所述的分离破囊壶菌生物质，其特征在于，约1.5重 量％或更少的所述脂肪酸是花生四締酸，且其中二十二碳六締酸与花生四締酸的重量比为 至少约20:1。
[0052] 16.如项10到15中任一项所述的分离破囊壶菌生物质，其特征在于，所述生物质 还含有重量比为至少约10:1的二十二碳六締酸与二十二碳五締酸n-6。
[0053] 17. -种含有项1到9中任一项所述的破囊壶菌微生物或其混合物的分离破囊壶 菌培养物。
[0054] 18.如项17所述的分离破囊壶菌培养物，其特征在于，所述破囊壶菌培养物还包 括至少约5 %的溶解氧。
[00巧]19. 一种用于动物或人的食品、化妆品或药物组合物，其包括项1到16中任一项所 述的破囊壶菌微生物或破囊壶菌生物质或其混合物。
[0056] 20. -种含有至少约70重量％甘油S醋组分的微生物油，其中，所述甘油S醋组 分的二十二碳六締酸含量为至少约50重量％，其中所述甘油=醋组分的二十二碳五締酸 n-6含量为约0. 5重量％ -约6重量％。
[0057] 21.如项20所述的微生物油，其特征在于，所述微生物油中所述甘油=醋组分的 花生四締酸含量为约1. 5重量％或更少。
[0058] 22. -种含有至少约70重量％甘油S醋组分的微生物油，其中，所述甘油S醋组 分的二十二碳六締酸含量为至少约40重量％，其中所述甘油=醋组分的二十二碳五締酸 n-6含量为至少约0. 5重量％ -约6重量％，且其中二十二碳六締酸与二十二碳五締酸n-6 的比例为大于约6:1。
[0059] 23. -种含有至少约70重量％甘油S醋组分的微生物油，其中，所述甘油S醋组 分的二十二碳六締酸含量为至少约60重量％。
[0060] 24.如项20到23中任一项所述的微生物油，其特征在于，所述甘油立醋组分的至 少约20%甘油=醋在所述甘油=醋内的两个位置上含有二十二碳六締酸，所述位置选自 sn-1、sn-2和sn-3位置中的任意两个。
[006。 25.如项20到23中任一项所述的微生物油，其特征在于，所述甘油立醋组分的至 少约5 %甘油=醋在所述甘油=醋中sn-1、sn-2