一种铅-血红蛋白螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及检测领域，更具体地说，设及一种铅-血红蛋白馨合物及其制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 血红蛋白化emoglobin;皿；HGB)是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。是使 血液呈红色的蛋白。人类红细胞内有S种正常血红蛋白即化-A、A2及F。化-A是正常成人 红细胞内血红蛋白之主要成分，化-A2是次要成分约占2%，而化-F在正常成人或儿童之 红细胞中占2-3%W下，化-F在胚胎十月开始产生为胎儿红细胞之主要成分，足月新生儿 的红细胞中化-F占70-80%，其余为化-A，二个月后占50%，四个月后少于10%，六个月 后大部消失。血红蛋白除运输氧气二氧化碳，还可W导致血管疫李和血管收缩。在体内存 在的=种形式的血红蛋白，氧合血红蛋白、还原型血红蛋白及高铁血红蛋白，其中氧合血红 蛋白缩血管能力最强，而高铁血红蛋白几乎没有收缩血管活性。
[0003] 铅（Pb)是一种常见的有毒金属及环境污染物，广泛应用于工业生产环境中，包括 冶炼锻造、铅电池生产、汽油添加剂的生产过滤中等，与人们生活息息相关。对于普通人群， 主要是通过吸入铅污染的空气，或饮用W铅壶或铅锡壶盛装的酒，甚至使用或滥用含铅的 药物治疗慢性疾病而摄入铅。越来越多的研究证明铅可W对机体造成急性、慢性损伤，甚至 导致癌症的发生。美国毒物与疾病登记署公布研究表明，铅是一种全身性毒物，可W影响神 经、造血、内分泌、免疫、生殖、肝脏、肾脏等组织器官，国际肿瘤研究机构（IARC)也将铅及 其化合物列为第2B类人致癌物。可见铅对机体的影响及其重要，不可忽视。
[0004] 铅与多种蛋白质之间关系密化可W与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。 随着对铅毒性研究的深入，人们逐渐认识到铅与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重 要的角色，被认为是了解铅的毒性机理的关键所在，因此，对铅和蛋白质相互作用的研究就 显得愈发重要。而现在关于铅与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与铅之 间的关系还不清楚，因而加强对于铅与蛋白质之间的关系至关重要。
【发明内容】
[0005] 针对铅污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铅-血红蛋白馨合物及其制 备方法，并建立铅-血红蛋白馨合物的定性、定量检测方法，W便定量检测铅-血红蛋白馨 合物在评价一个地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铅-血红蛋白 馨合物可W间接反映该个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映该个地区铅污染程度。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种铅-血红蛋白馨合物，铅 离子与血红蛋白通过琉基或/和半脱氨酸残基馨合而成。
[0007] 本发明还提供一种上述的铅-血红蛋白馨合物的制备方法，包括W下步骤：
[0008] A)铅与血红蛋白的馨合反应；在提纯源于人体的血红蛋白或按照生物学方法重 组的血红蛋白中加入铅离子进行馨合反应，得到反应溶液；
[0009] B)纯化铅-血红蛋白馨合物的提取；采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反 应的血红蛋白W及多余的铅离子，即得铅-血红蛋白馨合物。
[0010] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：
[0011] (1)溶解样品；向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使铅-血红蛋白馨 合物复溶；
[001引 似平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与血红 蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0013] (3)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，血红蛋 白与填料特异性结合；
[0014] (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液I;
[0015] (5)收集：收集洗脱液I ;
[0016] (6)透析；将步骤巧）中的收集的洗脱液，装透析袋，用d地2〇透析除盐，换水S次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0017] (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铅特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0018] (8)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤化）中样本，然后上柱；
[0019] (9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液II;
[0020] (10)收集；收集洗脱液II;
[002。 （11)透析；将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用(1化0透析除盐，换水立 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得铅-血红蛋白馨合物。
[0022] 其中，上述铅-血红蛋白馨合物的制备方法，还包括步骤C);对铅-血红蛋白馨合 物的鉴定；
[0023] 其中，步骤C)中具体如下；
[0024] (1)制备胶床；W琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[00巧](2)加样；取步骤B)中提取纯化得到的铅-血红蛋白馨合物，加入稀释缓冲液，并 混匀，然后加样于样品槽中；
[002引 做电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0027] (4)检测；在胶床上找出含铅的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有铅W及检测铅的含量。
[0028] 本发明还提供一种如上述的铅-血红蛋白馨合物在制备检测人体内铅-血红蛋白 馨合物的试剂或试剂盒中的应用。
[0029] 本发明还提供一种至少包括如上述的铅-血红蛋白馨合物作为标准品的试剂盒。
[0030] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获血红蛋白的物质或捕获铅 的物质。
[0031] 本发明还提供一种定量检测铅-血红蛋白馨合物的方法，W已知含量的上述的 铅-血红蛋白馨合物作为标准品，采用W下方法之一对样品进行检测；酶联免疫法、酶联免 疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感禪合等离子体质谱结合法、提纯铅-血红蛋白 馨合物与酶联免疫结合法、提纯铅-血红蛋白馨合物与原子吸收光谱结合法、提纯铅-血红 蛋白馨合物与电感禪合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感禪合 等离子体质谱结合法。
[0032] 实施本发明的铅-血红蛋白馨合物及其制备方法和应用，具有W下有益效果：
[0033] 1.本发明首次体外合成铅-血红蛋白馨合物；
[0034] 2.本发明首次提出铅-血红蛋白馨合物可用于制备检测血样中铅-血红蛋白馨合 物的试剂或试剂盒中的应用。
[00巧]3.本发明建立了铅-血红蛋白馨合物的定性定量检测方法，W便定量检测铅-血 红蛋白馨合物在评价一个地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中 铅-血红蛋白馨合物可W间接反映该个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映该个地区 铅污染程度。本发明建立的铅-血红蛋白馨合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使 检测的重复性得到大大提高。
【附图说明】
[0036] 图1为本发明所述的铅-血红蛋白馨合物的非变性电泳条带图；
[0037]图2为本发明所述的铅-血红蛋白馨合物的电泳条带的同步福射X线巧光分析 图。
【具体实施方式】
[0038] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0039] 本发明除特别说明外，设及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可W通过市购方式 获得：
[0040] 磯酸盐溶液为0. 05-0.Imol/L化2册〇4溶液或0. 5-lmol/L化2册〇4溶液；
[0041] 提取试剂为PEG溶液、棚酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0042] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种；
[0043] 捕获血红蛋白的物质为上海江莱生物科技有限公司生产的型号为KAY0043的抗 血红蛋白抗体；其中，本发明所述与血红蛋白特异性结合的物质、抗皿抗体、抗血红蛋白抗 体均为捕获血红蛋白的物质；
[0044] 捕获铅的物质为己傲得生物科技有限公司生产的型号为AP7019的鼠抗化mAb; 其中，本发明所述与铅特异性结合的物质、抗Pb抗体、抗铅抗体、铅抗均为捕获铅的物质；
[0045] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磯酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0046] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[0047]红细胞裂解液的配方如下；139.6mmol/LNH4CI，16. 96mmol/LTris，用Imol/L肥 1 调抑至7.2;
[0048]洗漆液为含有KH2PO40. 2mg/ml、化2册〇4? 12&0 2. 90mg/ml、化C18.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑为 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[004引封闭液为1% -5 %牛血清白蛋白或脱脂奶粉；
[0050]稀释缓冲液为含 1. 5mg/mL化2〇)3、2. 93mg/mlNaHC〇3的PH为 9.6的 0. 05M碳酸 盐缓冲液；
[0051] 酶标抗体为HRP酶标抗体；
[0052] 终止液为：将21. 7ml的2M&8〇4定容至200ml的d地2〇中；
[0053] 洗脱液为含木瓜蛋白酶的PH为8. 0的0.Imol/LTris-HCL缓冲液；
[0054] 酸化剂为硝酸；
[00巧]上样缓冲液为含有 1MTris-HCl(pH6.8) 15. 5mL、1 %漠酪藍 2. 5mL、ddH2〇7mL、甘 氨酸 25血的Samplebuffer巧)〇 ;
[0056]电泳缓冲液为含Tris3mg/ml、甘氨酸14. 4mg/ml的PH为6.8的d地2〇溶液。
[0057] 本发明提供一种