一种检测端粒酶活性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及一种检测端粒酶活性的方法。
【背景技术】
[0002] 真核生物的细胞染色体末端具有端粒结构，它是由重复DNA序列与蛋白质构成的 复合物。端粒在细胞染色体中起重要作用，可以维持染色体完整与稳定，其长度反映了细胞 继续复制的潜在可能性。端粒能够防止染色体末端DNA喊基对自然丢失时影响有意义的基 因序列的结构。因此，随着细胞分裂的持续进行，正常细胞的端粒会不断缩短，最终过短的 端粒会使细胞无法继续分裂，从而使细胞寿命受到限制，防止细胞过度分裂。
[0003] 1984年，Ssampay等发现了由蛋白质与一段短RNA链组成的核糖核蛋白酶--端 粒酶，它是一种能够在真核生物染色体末端DNA重复添加序列（TTAGGG)n并使DNA得以延 长的逆转录酶。端粒酶在肿瘤细胞中大量表达且活性明显增强，而在正常组织细胞中活性 极低甚至无活性，这一特点使得端粒酶的检测成为了肿瘤检测与治疗中的新课题。
[0004] 端粒酶本身带有一段模板RNA，利用这段RNA，端粒酶能够在端粒末端逆转录合成 端粒DNA的重复序列，以此维持端粒长度，目前对端粒酶的检测方法皆基于此特性。最早的 端粒酶活性检测方法为端粒重复序列延伸法，该方法灵敏度低，检测时间长，检测所需样品 量大，但检测中放射性同位素用量较高，易污染环境。常用的端粒酶活性检测方法还包括荧 光素标记的端粒重复序列扩增法和杂交保护法等，但这两种方法对微量端粒酶活性的定量 检测结果不可靠或灵敏度较低。转录介导的扩增/杂交保护法虽然特异性好、灵敏度高，但 需要用到特殊仪器，且所需探针难以获取，因而不易推广。
[0005] 在泌尿外科肿瘤领域，由于患者的尿液中含有脱落细胞，对新鲜尿液中细胞的端 粒酶的检测，可以对泌尿肿瘤的诊断起到参考作用。这作为一种无创检查手段，在膀胱癌等 泌尿肿瘤的早期诊断中有着重要意义。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种检测端粒酶活性的方 法，其目的在于端粒酶能够延长引物序列，而使引物序列上结合的AIE染料聚集发光，由此 解决对端粒酶活性特异性检测的技术问题。
[0007] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种检测端粒酶活性的方法，其 特征在于，利用端粒酶引物的核苷酸序列在端粒酶的催化下延伸的特性，使得AIE染料聚 集于延伸的核苷酸序列而发出荧光；通过荧光强度得知端粒酶的活性；
[0008] 其中，所述端粒酶引物核苷酸序列包括如SEQ NO: 1所示的序列；所述AIE染料为 带正电基团的聚集诱导发光化合物，正电基团用于与带负电荷的核苷酸序列相结合。
[0009] 优选地，该方法的具体步骤为：
[0010] 步骤一：将待测样本、端粒酶引物、AIE染料以及端粒酶扩增试剂混合成为反应体 系；
[0011] 步骤二：将所述反应体系先于23°C~37°C下恒温孵育，使端粒酶引物发生延伸反 应，再于80°C~100°C下灭活，使得延伸反应停止；
[0012] 步骤三：检测反应体系中荧光强度的变化值，得知待测样本中的端粒酶活性。
[0013] 作为进一步优选地，所述端粒酶扩增试剂包括dNTPs、RNA酶抑制剂以及端粒酶扩 增缓冲溶液。
[0014] 作为进一步优选地，反应体系中dNTPs的浓度为0. 05mM~2. OmM，RNA酶抑制剂的 浓度为〇. IU/ μ L~1.0 U/ μ L，端粒酶引物的浓度为1. 0 μ M~10. 0 μ M ;端粒酶扩增缓冲溶 液包括 IOmM ~40mM 的 Tris、l. OmM ~2. OmM 的 MgCl2, pH 值为 7. 0 ~8. 0。
[0015] 作为进一步优选地，所述待测样本为细胞的端粒酶提取物。
[0016] 作为进一步优选地，待测样本的提取方法为，4°C以下离心分离出细胞后用CHAPS 裂解液裂解细胞，再离心后取上清液即得所需待测样本；上述细胞包括人体中取样或者自 然脱落的细胞，例如尿液中的沉降细胞、膀胱洗出液中的细胞、外周血细胞、活检组织等；其 中 CHAPS 裂解液包括 IOmM ρΗ7· 5 的 Tris-HCl、lmM MgCl2、lmM EGTA、0.1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)、5mMf3-巯基乙醇、质量分数为0.5%的3-[3-(胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内 盐（CHAPS)以及质量分数为10 %的甘油。
[0017] 作为进一步优选地，所述AIE染料在反应体系中的浓度为1 μΜ~100 μΜ。
[0018] 优选地，AIE染料为TPE-Z，其结构式如下所示
[0019]
[0020] 或为SiloleR，其结构式如下所示
[0021]
[0022] 为了达到降低背景荧光、提高检测特异性的效果，可以在端粒酶引物的核苷酸序 列的5'端修饰猝灭基团，使得体系中不存在端粒酶时，AIE染料的背景荧光由于荧光共振 能量转移（FRET)效应而降低，加入端粒酶后，端粒酶引物发生延伸反应，AIE染料与猝灭基 团之间的距离增大，FRET效应减弱，体系荧光大幅增加。同时，为了获得不同发射波长的荧 光检测效果，可以在端粒酶引物的核苷酸序列的3'端修饰荧光基团，使得体系中不存在端 粒酶时，荧光基团的背景荧光较低，而加入端粒酶后，端粒酶引物发生延伸反应，每根端粒 酶引物上聚集的AIE染料分子数目增大，AIE染料与荧光基团间的FRET效应增强，使得荧 光基团的荧光强度增大。
[0023] 优选地，所述核苷酸序列的5'端修饰有猝灭基团，和/或3'端修饰有荧光基团。
[0024] 作为进一步优选地，所述核苷酸序列的5'端修饰有猝灭基团且3'端修饰有荧光 基团。
[0025] 作为进一步优选地，所述猝灭基团为Dabcyl。
[0026] 优选地，由于体外培养的肿瘤细胞中含有大量的端粒酶，检测中以肿瘤细胞的端 粒酶提取物作为阳性对照，例如E-J细胞、MCF-7细胞、HeLa细胞。
[0027] 按照本发明的另一方面还提供了一种以上述方法检测端粒酶活性的试剂盒，其特 征在于，包括：带正电基团的聚集诱导发光化合物、端粒酶引物、dNTPs、RNA酶抑制剂以及 端粒酶扩增缓冲溶液，所述端粒酶引物核苷酸序列包括如SEQ NO: 1所示的序列。
[0028] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于利用了带正 电基团的聚集诱导发光化合物能与带负电的DNA分子磷酸骨架结合的特性，能够取得下列 有益效果：
[0029] 1、利用端粒酶特异性对端粒酶引物序列的延伸，从而使聚集诱导发光化合物聚集 发出荧光，实现了特异性的检测；
[0030] 2、AIE染料与端粒酶引物之间通过静电引力连接，无需共价键连接，操作简便；
[0031] 3、优选在端粒酶引物的核苷酸序列的5'端修饰猝灭基团，或在3'端修饰焚光基 团，利用FRET效应进一步提高了检测的灵敏度和特异性；
[0032] 4、检测限低，可检测出低至10个肿瘤细胞中提取的端粒酶。
【附图说明】
[0033] 图1为本发明的原理示意图；
[0034] 图2为实施例1-3中对不同样本进行检测的结果；
[0035] 图3为实施例4-6对膀胱癌细胞E-J、子宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF-7进行 检测所得的浓度曲线，其中I为实验组在478nm处的荧光强度，I。为对照组在478nm处的荧 光强度；N表示细胞个数；误差棒为3组平行实验的标准差；
[0036] 图4为实施例7对23例膀胱癌病人清尿样本和18例膀胱癌病人血尿样本进行检 测的结果。
【具体实施方式】
[0037] 按照本发明的一个方面，提供了 一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于，利用端 粒酶引物的核苷酸序列在端粒酶的催化下延伸的特性，使得AIE染料聚集于延伸的核苷酸 序列而发出荧光；通过荧光强度得知端粒酶的活性；
[0038] 其中，所述端粒酶引物核苷酸序列包括如SEQ NO: 1所示的序列；所述AIE染料为 带正电基团的聚集诱导发光化合物，正电基团用于与带负电荷的核苷酸序列相结合。
[0039] 优选地，该方法的具体步骤为：
[0040] 步骤一：将待测样本、端粒酶引物、AIE染料以及端粒酶扩