一种用于预示牦牛肌肉嫩度的pcr-sscp引物对及检测试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物分子生物学与基因工程技术领域，具体涉及一种用于预示牦牛肌 肉嫩度的PCR-SSCP引物对及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 牛肉嫩度受宰前和宰后的多种因素影响，但遗传对其也有重要作用。目前对普通 牛肌肉嫩度从分子水平开展了大量研宄，定位了一些与嫩度有关的QTL或主基因，确定了 一些牛肉嫩度候选基因并阐明了其结构和群体遗传多态性，筛选出与牛肉嫩度紧密连锁的 分子标记，部分分子标记已通过GeneSTAR Tenderness等开展商业检测。
[0003] 钙蛋白酶水解系统是一个普遍存在于人和动物机体内的高度复杂的调控体系， 主要由钙蛋白酶（CAPN)及钙蛋白酶抑制蛋白（CAST)、骨骼肌特异性钙蛋白酶（P94)组成。 CAPN降解肌细胞肌原纤维，CAST高效、专一性的抑制CAPN的水解，即CAST广泛存在于细 胞内，可以识别钙离子激活后引起的钙蛋白酶构象变化，并与之结合，从而抑制钙蛋白酶活 性。CAST作为CAPN内源性特异抑制因子，屠宰后24h CAST的活性通常能解释牛肉嫩度约 40%的差异，因此也确定为嫩度候选基因。普通牛CAST基因位于第7号染色体，CAST基因 突变与一些普通牛品种的肌肉嫩度相关；猪CAST基因对猪肉的蒸煮损失、系水力、多汁性、 背膘厚、大理石花纹等均有影响；绵羊CAST基因表达量与背最长肌失水率相关。
[0004] 牦牛是青藏高原及其周边高寒牧区的特有牛种，也是重要的生产和生活资源。近 年来，国内外从比较基因组学、牦牛起源、演化和分类等方面，对牦牛遗传特性开展了较多 研宄，也对一些重要经济性状候选基因进行了探索，但均未见报道相应基因对牦牛肌肉嫩 度的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种用于预示牦牛肌肉嫩度的PCR-SSCP引物对及检测试剂盒。
[0006] 本发明以CAST基因作为肌肉嫩度性状候选基因，研宄其预示和检测牦牛肌肉嫩 度性状的分子标记方法，为牦牛肉质改良提供技术支撑。
[0007] 本发明提供一种用于预示牦牛肌肉嫩度的PCR-SSCP引物对，所述引物对为： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr ； CAST-R :5^ -TACACCCTGCTTTGTCCTCCA-3^。
[0008] 本发明还提供一种用于预示牦牛肌肉嫩度的PCR-SSCP检测试剂盒，所述试剂盒 包含以下引物对： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr ； CAST-R :5^ -TACACCCTGCTTTGTCCTCCA-3^。
[0009] 优选地，所述试剂盒还包括牦牛CAST*D的DNA标准样，所述CAST*D的DNA标准样 的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No. 4。
[0010] 本发明的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，步骤如下： (1) 样品米集和DNA的提取； (2) 待测样本DNA的PCR扩增；所用引物为： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr , CAST-RiSr -TAcAccCTGCTTTGTCCTCCA-Sr ； (3) SSCP电泳：将CAST*D的DNA标准样和待测样本DNA同时进行SSRP电泳，电泳结束 后染色判定基因型，携带等位基因 CAST*D的待测样本肌肉嫩度高。
[0011] 优选地，所述PCR扩增时的反应条件为：95°C预变性2min ;94°C变性30s，64°C退 火30s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0012] 本发明的第四个目的是提供一种牦牛肌肉嫩度性能的预示方法，步骤如下： (1) 样品米集和样品DNA的提取； (2) 待测样本DNA的PCR扩增；所用引物为： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr , CAST-RiSr -TAcAccCTGCTTTGTCCTCCA-Sr ； (3) SSCP电泳：将CAST*D的DNA标准样和待测样本DNA同时进行SSRP电泳，电泳结束 后染色判定基因型，携带等位基因 CAST*D的待测样本肌肉嫩度高。
[0013] 优选地，所述PCR扩增时的反应条件为：95°C预变性2min ;94°C变性30s，64°C退 火30s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0014] 本发明的第五个目的是提供一种牦牛肌肉嫩度性能的分子选种方法，步骤如下： (1) 样品米集和DNA的提取； (2) 待测样本DNA的PCR扩增；所用引物为： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr , CAST-RiSr -TAcAccCTGCTTTGTCCTCCA-Sr ； (3) SSCP电泳：将CAST*D的DNA标准样和待测样本DNA同时进行SSRP电泳，电泳结束 后染色判定基因型，选择携带CAST*D待测样本，即为肌肉嫩度高的牦牛个体。
[0015] 优选地，所述PCR扩增时的反应条件为：95°C预变性2min ;94°C变性30s，64°C退 火30s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0016] 本发明的第六个目的是提供上述引物对、试剂盒或CAST*D的DNA标准样在检测和 预示牦牛肌肉嫩度性状以及牦牛肌肉嫩度分子选种中的应用。
[0017] 本发明根据牦牛CAST第3内含子区基因序列设计了一对引物，对牦牛基因组DNA 进行PCR扩增后进行SSCP分型筛选检测，通过分析带型确定牦牛CAST基因型和等位基因， 通过等位基因序列比对确定SNPs突变，并分析CAST基因突变对肌肉嫩度剪切力值的影响。 本发明的方法采用PCR-SSCP技术，通过对牦牛CAST基因的不同基因型、等位基因检测，从 而预测该牛的肌肉嫩度优劣。本发明的优点是反应灵敏、特异性强、操作简单、精确度高，可 进行快速检测。
【附图说明】
[0018] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为本发明的牦牛肌肉嫩度性状候选基因 CAST的等位基因 SSCP带型图。
【具体实施方式】
[0019] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常 规生化试剂。下面以甘南牦牛CAST基因分型及肌肉嫩度预测技术的建立为例，对本发明内 容进行详细的说明。
[0020] 实施例1 设计牦牛肌肉嫩度候选基因 CAST的PCR-SSCP检测引物，具体为： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr ； CAST-R :5' -TACACCCTGCTTTGTCCTCCA-3'。引物由北京六合华大基因公司合成。
[0021] 实施例2制备牦牛肌肉嫩度候选基因的PCR-SSCP检测试剂盒 牦牛肌肉嫩度候选基因 CAST的PCR-SSCP检测试剂盒包括有PCR反应液，CAST*D的DNA 标准样；去离子水，10%过硫酸按，上样变性缓冲液，TEMED (四甲基乙二胺)，12%非变性聚丙 稀酰胺凝胶Acr: Scr=39:1 ; 其中，上样变性缓冲液包括98%去离子甲酰胺、0. 025%溴酚蓝、0. 025%二甲苯氰、10 mmol/L EDTA，pH8.0 ; PCR反应的反应液：总体积20 μ L，其中DNA模板0.8 μ L，上、下游引物各0.4 μ L， TaKaRa Premix Taq 聚合酶 11 μ L，灭菌超纯水 7· 4 μ L0
[0022] CAST*D 的 DNA标准样的核苷酸序列为：cgtagtgatgctttctaaggcccacttgacttcac attccaggatatctggctctaggtgagtgatcacaccatcgtgattatcttggtcgtgaagatctctaggtgagata aaaccaaggtaaagagttaaaagtaagtatggttaaaagggacttccaccatgactcatttggtaaagaatctgcct gcaatgcaagagacccagcttccatccctgggtcaggaagatcccctagagaagggaatggcaacttactccagtat tcttgcctggagaattccattgacagagaaaccctgcaggctacagttcatgaggttgcaaagagtcggccacgatt gagtgactaacactactacactgctgtggttaaaaggaggtggaggacaaagcagggtgta 实施例3应用本发明的试剂盒检测牦牛肌肉嫩度候选基因的方法 (1) 样品米集：耗牛颈静脉米血10ml，A⑶抗凝，_70°C冻存； (2) 基因组DNA的提取：用苯酚-氯仿法从冻存血样中提取基因组DNA ; (3) 聚合酶链式反应： PCR反应体系：总体积 20 μ L，DNA模板 0· 8 μ L，引物 CAST-F和 CAST-R各0· 4 μ L，TaKaRa Premix Taq聚合酶IlyL，灭菌超纯水7. 4yL;反应条件：95°C预变性2 min;94°C变性30 s，64°C退火30 s，72°C延伸30 s，共35个循环；最后72°C延伸10 min; 引物序列为： CAST-FiSr -CGTAGTGATGCTTTCTAAGGC-Sr ； CAST-R :5^ -TACACCCTGCTTTGTCCTCCA-3^。
[0023] (4 ) PCR 产物的 SSCP 检测： 取2 μ L的PCR产物加入8 μ L变性上样缓冲液（98%去离子甲酰胺、0. 025%溴酚蓝、 0. 025%二甲苯氰、10 mmol/L EDTA pH8. 0)，98°C变性5min，迅速冰浴5min后，上样到 10%非 变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr: Scr=39:1)，300V电压、电泳室温度4°C、电泳槽水循环温度4°C 电泳18h，银染法显色后判定基因型。
[0024] (5)结果判断： 通过对牦牛因第三内含子的PCR-SSCP检测，发现有6个等位基因，对牦牛肌肉 嫩度具有影响的等位基因为CAST*D ;对牦牛肌肉嫩度无影响的等位基因为CAST*A、*B、*C、 *E 和 *F。
[0025] 控制牦牛肌肉嫩度的等位基因为CAST*D的核苷酸序列为： cgtagtgatgctttctaaggcccacttgacttcacattccaggatatctggctctaggtgagtgatcacac catcgtgattatcttggtcgtgaagatctctaggtgagataaaaccaaggtaaagagttaaaagtaagtatggtta aaagggacttccaccatgactcatttggtaaagaatctgcctgcaatgcaagagacccagcttccatccctgggtca ggaagatcccctagagaagggaatggcaacttactccagtattcttgcctggagaattccattgacagagaaaccct gcaggctacagttcatgaggttgcaaagagtcggccacgattgagtgactaacactactacactgctgtggttaaaa ggaggtggaggacaaagcagggtgta 对牦牛肌肉嫩度无影响的等位基因为CASI^A的核苷酸序列为：cgtagtgatgctttctaag gcccacttgacttcacattccaggatatctggctctaggtgagtgatcacaccatcgtgattatcttggtcgtgaag atctctaggtgagataaaaccaaggtaaagagttaaaagtaagtatggttaaaagggacttccaccatgactcattt ggtaaagaatctgcctgcaatgcaagagacccagcttccatccctgggtcaggaagatcccctagagaagggaatgg caacttactccagtattcttgcctggagaattccattgacagagaaacccggcaggctacagttcatgaggttgcaa agagtcggccacgattgagtgactaacactactacactgctgtggttaaaaggaggtggaggacaaagcagggtgta 对牦牛肌肉嫩度无影响