一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用，属于生物技术技术领 域。
【背景技术】
[0002] 目前，由于石油的日益枯竭，玉米秸杆、麦杆和甘蔗渣等农业废弃物转化成原油可 替代液体燃料（特别是生物乙醇）生产技术的研发被高度重视。该工艺，首先采用水热处理 法、稀酸法、SPORL法等物理化学方法处理秸杆，然后用纤维素酶制剂酶解预处理后的原料， 转化成可发酵性单糖，然后添加酵母、梭菌等微生物发酵成乙醇、丁醇等液体燃料/化工产 品。
[0003] 然而，市售的酶制剂大部分来源于里氏木霉发酵而得，酶系组成中beta-葡萄糖 苷酶活性较低，造成酶解过程产生较多的纤维二糖，阻碍了纤维素的有效降解，导致单糖转 化率较低。同时，酵母不能利用纤维二糖，因此导致最终乙醇发酵得率也不高。
[0004] 中国专利文献CN102787104A(申请号201210260079. 2)公开了一种高活性复合纤 维素酶及其制备和在木质纤维酶解糖化中的应用方法。利用爪哇正青霉ZN - 205进行摇 瓶发酵产β -葡萄糖苷酶，最佳产酶条件：初始pH为6.0,蛋白胨浓度为0.75%，微晶纤 维素浓度为2. 5%，吐温一 80的添加量为0. 05%，培养温度为28°C，250ml三角瓶装液量为 100ml，摇床转速为175r/min，接种量为5%;最高β -葡萄糖苷酶活为2. 312IU/ml。将爪 哇正青霉ZN - 205生产的β -葡萄糖苷酶与里氏木霉Rut C - 30生产的纤维素酶进行 酶系复合，获得最优β -葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为1.4。该申请需要采用两种不同 的微生物进行生产酶液，然后进行酶系复合。不利于工业化生产。
[0005] 中国专利文献CN102286446A(申请号201110162149. 6)公开了一种用于玉米芯废 渣转化制备单糖的复合酶，其包含：纤维素酶10~48FPU/g底物，果胶酶0~17. 2IU/g底 物，表面活性剂0~1% (v/v)。该发明利用不同来源纤维素酶的复配及其与表面活性剂的 协同作用，降低了生产中的用酶成本，大大提高了玉米芯废渣的糖化率，高达74. 8%。
[0006] 中国专利文献CN102071223A(申请号200910172724. 3)公开了一种秸杆类原料的 复合酶解方法，秸杆类原料先经稀酸水解降解木质素，然后加入木聚糖酶、纤维素酶、淀粉 酶、果胶酶和β -葡聚糖酶，用酸性物质或碱性物质调整混合物pH为4. 3~5. 5,然后在 40~55°C下进行酶解24~72h。本发明采用复合酶的方法使秸杆类酶解转化为还原糖，选 择合适的复合酶配比，使得酶之间产生相互作用，使得水解达到最大化，酶解产生的还原糖 浓度高，得糖率高，酶解条件温和，对后期发酵无不良影响，不会抑制后期发酵的菌种生长， 发酵时的乙醇产量高。但上述技术方案需要将几种酶制剂木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶、果 胶酶和β-葡聚糖酶进行酶系复配。
[0007] 目前，制备纤维素酶和半纤维素酶往往利用丝状真菌进行生产，而改造丝状真菌 工业菌株提高纤维素酶和半纤维素酶酶活的方法有诱变育种技术，原生质体融合技术，基 因重排技术等。
【发明内容】
[0008] 本发明针对现有技术的不足，提供一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应 用。通过改造丝状真菌工业菌株，提高酶系中beta-葡萄糖苷酶酶活性，改善酶系的成分， 从而提高木质纤维素制备可发酵单糖以及酒精产率的方法。
[0009] 本发明技术方案如下：
[0010] 一种重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH，其特征在于，利用NotI酶将pUG6质粒切成线 性质粒，然后将PCR扩增获得的里氏木霉木聚糖解酶II启动子（XYN2upStream)、β -葡萄 糖苷酶的编码基因（Glucosidase)以及终止子（Terminator)、潮霉素磷酸转移酶的编码基 因片段（HPH)和里氏木霉木聚糖解酶II终止子（XYN2downstream)依次与上述线性质粒连 接，制得重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH(如图1所示）；
[0011] 所述葡萄糖苷酶的编码基因核苷酸序列（Glucosidase)如SEQ ID NO. 1所 示，其终止子（Terminator)如SEQ ID NO. 5所示；里氏木霉木聚糖解酶II启动子的核苷 酸序列（XYN2upStream)如SEQ ID NO. 2所示；里氏木霉木聚糖解酶II终止子的核苷酸序 列（XYN2downstream)如SEQ ID NO. 3所示；潮霉素磷酸转移酶的编码基因的核苷酸序列 (HPH)如 SEQ ID NO. 4 所示。
[0012] 根据本发明优选的，所述连接采用Clotech公司的In-Fusion PCR Cloning试剂 盒进行。
[0013] 根据本发明优选的，所述的重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0014] -株重组工程菌，以里氏木霉（Trichoderma reesei)QM9414或其变异菌种为原始 菌，经转化上述重组质粒PUG6-XYN2-GLU-HPH后制得。
[0015] 根据本发明优选的，所述里氏木霉（Trichoderma reesei)QM9414来源于美国模式 培养物集存库（ATCC)，菌种保藏号ATCC 26921。
[0016] 上述重组工程菌在降解纤维素原料中的应用。
[0017] 根据本发明优选的，所述的降解为利用上述重组工程菌经培养后制备纤维素酶解 液，然后利用纤维素酶解液处理纤维素原料。
[0018] 根据本发明进一步优选的，所述的纤维素酶解液，按如下步骤制备：
[0019] (1)取上述重组工程菌，接种于种子培养基中，经种子培养后，制得种子液；
[0020] (2)将步骤（1)制得的种子液接种于产酶培养基中，经发酵培养，制得发酵液；
[0021] 所述的产酶培养基，组分如下，均为重量百分比：
[0022] 玉米芯粉1. 0~3. 0%，蛋白胨0. 5~2. 0%，麸皮1. 0~4. 0%，微晶纤维素0~ 1. 〇%，硝酸钠0~1. 〇%，硫酸铵〇· 1~〇· 5%，磷酸二氢钾0· 1~0· 5%，硫酸镁0· 04~ 0. 1 %，尿素0~0. 4%，吐温800~0. 4%，余量水；
[0023] (3)将步骤（2)制得的发酵液经固液分离，取上清，制得纤维素酶解液。
[0024] 所述步骤（1)中的种子培养基，组分如下，均为重量百分比：
[0025] 葡萄糖0· 5~2. 0%，蛋白胨0· 5~2. 0%，麸皮L 0~4. 0%，硝酸钠 0~L 0%， 硫酸铵〇· 1~0.5%，磷酸二氢钾0· 1~0.5%，硫酸镁0.04~0· 1%，尿素0~0.4%，余 量水。
[0026] 所述步骤（1)中，种子培养条件为：在25~32°C的条件下，培养20~30小时。
[0027] 所述步骤⑵中，按体积百分比5~10%的比例进行接种。
[0028] 所述步骤（2)中，发酵培养条件为：在25~30°C的条件下，培养5~7天。
[0029] 所述步骤（3)中，固液分离为离心，条件为10000~15000r/min离心12~18min。
[0030] 根据本发明进一步优选的，所述利用纤维素酶解液处理纤维素原料的步骤如下：
[0031] (i)对含纤维素的生物质原料进行前处理，按15~25% (质量百分比）固形物终 浓度将前处理后的生物质原料和水进行混合，然后调节PH值范围至5. 0~6. 0,再按每克 绝干生物质原料添加8~15FPU的比例加入纤维素酶解液，在45~50°C温度下振荡反应 32~40h，经固液分离，制得水解液；
[0032] (ii)取步骤⑴制得的水解液，按照质量百分比1~5%的比例接种高温酵母，在 28~32°C进行厌氧发酵培养45~50小时，经纯化分离，制得乙醇。
[0033] 所述步骤（i)中，前处理为酸处理、碱处理、水热处理、亚临界水处理、微粉碎处 理、蒸煮处理、干燥处理、亚硫酸盐处理、水热处理；优选，亚硫酸盐处理、水热处理、稀硫酸 处理。
[0034] 所述步骤⑴中，固液分离为离心分离，离心分离条件为8000rpm离心30min。
[0035] 所述步骤（ii)中，纯化分离为蒸馏分离。
[0036] FPU是指滤纸酶活力单位。向试管中加入50mg滤纸（用葡萄糖制作标准曲线）， I. 5ml醋酸缓冲液（50mM，ρΗ4· 8)，加入(λ 5ml酶液，50°C水浴60min，后加入2. 5ml DNS终 止反应，煮沸10分钟后，定容到25ml，摇匀后OD54ffI定吸光度值。截取在60min释放2. Omg 葡萄糖当量的还原糖（转化率4% )计算滤纸酶活力（FPA)，单位以FPU表示。
[0037] 有益效果
[0038] 1、本发明首次构建了能够表达高酶活的beta-葡萄糖苷酶的重组质粒，该重组质 粒表达的高酶活beta-葡萄糖苷酶能够改善纤维素酶降解木质纤维素的效率。
[0039] 2、将本发明构建的高酶活的beta-葡萄糖苷酶的重组质粒导入丝状真菌里氏木 霉（Trichoderma reesei)QM9414(ATCC26921)中，能够有效提高beta-葡萄糖苷酶酶活性， 改善酶系的成分，提高纤维素酶降解木质纤维素的效率及酒精产率。
【附图说明】
[0040] 图1为里氏木霉重组表达载体PUG6-XYN2-GLU-HPH的构建图；
[0041] 其中：XYN2upstream为启动子；Glucosidase为来源于黑曲霉的β -葡萄糖苷酶 表达的基因；Terminator和XYN2downstream为终止子；HPH为潮霉素基因筛选标记盒； BamHI、HindIII、BglII 和 NotI 为酶切位点；
【具体实施方式】
[0042] 下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步的阐述，应该说明