抗hgf/vegf双特异性抗体、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类双特异性抗体和其制备 方法，以及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡 中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率 高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程 度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提 商。
[0003] 肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长期转为有血管的快速 增殖期，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期，如果没有血管的生成，原 发肿瘤的生长不超过1~2mm，转移则无法实现。血管内皮生长因子（VEGF)是一类能促进 血管内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成并能提高血管通透性的生长因子，它们与细 胞表面的血管内皮生长因子受体（VEGFR)结合后，通过激活酪氨酸激酶信号转导通路发挥 功能。VEGFR属于酪氨酸激酶受体超家族，它们有相似的结构，均由胞外区、跨膜区、胞内区 组成。目前发现的 VEGFR 主要有 3 种：VEGFRl (Flt-1)，VEGFR2 (KDR)，VEGFR3。与 VEGFRl 结合的主要是VEGF-A、VEGF-B，与VEGFR2结合的主要是VEGF-A、VEGF-C、
[0004] VEGF-D、VEGF-E，与 VEGFR3 结合的主要是 VEGF-C、VEGF-D。VEGFRl 和 VEGFR2 主要 位于肿瘤血管内皮细胞表面，VEGFRl主要介导细胞骨架重排及引起细胞迁移，而VEGFR2介 导内皮细胞的增殖、分化；VEGFR3特异表达在淋巴内皮细胞中，在动脉、静脉、毛细血管内 皮中基本没有表达。VEGF-C和VEGF-D可通过VEGF-C/VEGF-D/VEGFR3信号系统发挥作用， 从而导致肿瘤淋巴管的增生和淋巴结的转移（Neufeld G等，FASEB J，1999,13:9-22)。在 肿瘤组织中，
[0005] 肿瘤细胞、肿瘤浸润的巨噬细胞和肥大细胞等能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的 形式刺激肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长；另外，高水平 的VEGF还能提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞和 内皮细胞浸润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。因此，抑 制肿瘤血管生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。Genentech公司的抗癌 新药Bevacizumab (抗VEGF人源化抗体）已于2004年2月获得美国FDA批准上市，目前 Bevacizumab与常规化疗药联合应用可用于治疗转移性结直肠癌以及非鳞状的非小细胞肺 癌的一线治疗。
[0006] 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF)是存在于急性肝损伤动物血 浆中的蛋白因子，它能刺激肝细胞的DNA合成，且在肝再生过程中起重要作用。HGF由728 个氨基酸构成，其活性形式是由一条69kd重链a和一条34kd轻链b组成的异二聚体，a链 N端有一发夹结构；b链有丝氨酸蛋白酶样结构。受体酪氨酸激酶（c-Met)是HGF的特异性 细胞表面受体，表达于多种正常组织细胞(如心肌细胞、血管内皮细胞等）和肿瘤细胞的膜 表面，介导HGF所有的生物学作用。愈来愈多的报道表明，HGF是一种作用广泛的因子，除 对肝细胞作用之外，还对多种组织和细胞具有调控作用，其中最显著的是促细胞分裂和促 细胞运动作用。HGF能剂量依赖性地促进血管内皮细胞的增殖，而且HGF刺激内皮细胞增殖 的能力明显强于碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和VEGF，提示HGF具有强大的促进血管生 成作用。目前已证实，不论是离体还是在体，HGF都能够明显地促进VEGF的mRNA表达，而 且这两种细胞生长因子在促血管生成方面具有协同作用。在肿瘤组织中，通过自分泌或旁 分泌方式产生的HGF能刺激内皮细胞的分裂和增殖，同时也能促进肿瘤细胞自身的生长和 转移。
[0007] 因此，研究出既能与血管内皮细胞表面的VEGFR竞争性结合VEGF，同时又能与 c-Met竞争性结合HGF的双特异性抗体，从而更加有效地阻断新生血管形成，同时又达到抑 制肿瘤细胞生长和转移的目的，这类高效抗肿瘤药物一直是本领域的技术人员急待解决的 问题。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述问题，本发明的发明人进行了大量试验，最终获得了一个既能与HGF 结合，还能与VEGF相结合的双特异性抗体，即本发明所述的"抗HGF/VEGF双特异性抗体"， 从而完成了本发明。
[0009] 本发明公开了 ：
[0010] 1.抗HGF/VEGF双特异性抗体，其既能与HGF结合，还能与VEGF相结合。
[0011] 2.上述抗HGF/VEGF双特异性抗体，其包含抗HGF单克隆抗体可变区和抗VEGF单 克隆抗体可变区。
[0012] 3.上述1或2所述的抗HGF/VEGF双特异性抗体，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示,重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0013] 4. 一种分离的核酸分子，其编码上述1-3任一所述的抗HGF/VEGF双特异性抗体， 优选地，编码所述抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，编码所述抗体重链的核苷酸 序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 5. -种载体，含有上述4所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表 达调控序列，优选地，所述载体可以为pCHOl. 0、pBudCE4. 1或pCGS3,最优选地，所述载体为 pCHOL 0。
[0015] 6. -种宿主细胞，其含有上述5所述的载体。优选地，所述细胞为真核细胞，更优 选地，为哺乳动物细胞，可以为COS、CH0、NSO细胞；最优选地，所述宿主细胞为CHO-S'或 CHOZN'°，GS+细胞。
[0016] 7. -种制备上述1~3任一所述的抗HGF/VEGF双特异性抗体的方法，该方法包括 步骤：
[0017] a)在表达条件下，培养上述6所述的宿主细胞，表达上述抗HGF/VEGF双特异性抗 体；
[0018] b)分离或纯化a)所述的抗HGF/VEGF双特异性抗体。
[0019] 优选地，所述制备方法包括以下步骤：
[0020] a)构建抗HGF/VEGF双特异性抗体的重链融合基因和轻链融合基因；
[0021] b)将上述a)融合基因克隆到表达载体pCHOl. 0,构建表达载体pCHOl. (KDVD-HGF/ VEGF)；
[0022] c)将上述b)表达载体pCHOl. 0 (DVD-HGF/VEGF)转染CHO细胞，筛选，进行亚克 隆，将筛选得到的高表达克隆进行扩大培养；
[0023] d)分离或纯化c)所得抗HGF/VEGF双特异性抗体。
[0024] 8. -种组合物，含有上述1~3任一所述的抗HGF/VEGF双特异性抗体和药学上可 接受的载体。
[0025] 9.上述1或2所述的抗HGF/VEGF双特异性抗体或8所述组合物在制备抗肿瘤药 物中的用途。
[0026] 10.上述9所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。
[0027] 任何编码抗HGF抗体可变区和抗VEGF抗体可变区的合适的DNA都适合于本发明。
[0028] 本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pCH01.0、pBudCE4.1或pCGS3之 一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
[0029] 哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统可用于本发明的融合蛋白的表达，COS、CH0、 NS0、sf9及sf21等动物细胞均可适用于本发明，优选C0S、CH0、NS0细胞，最优选CHO细胞； 也可为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a、BL21(DE3)和TGl之一。
[0030] 本发明中公开的抗HGF/VEGF双特异性抗体的制备方法为，在表达条件下培养上 述宿主细胞，从而表达双特异性抗体，进而分离或纯化所述的双特异性抗体。
[0031] 可以利用亲和层析的方法对本发明公开的双特异性抗体进行分离纯化，根据所利 用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和 柱上的融合蛋白多肽。
[0032] 利用上述方法，可以将融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上 显示为单一条带。
[0033] 本发明公开的上述抗HGF/VEGF双特异性抗体是通过以下方法得到的：抗VEGF 单抗Bevacizumab的全长基因（轻链和重链）序列根据Drug Bank所公布的氨基酸序列 (Accession Number:DB00112)由苏州金唯智技术服务有限公司全基因合成，全人源抗HGF 单抗的全长基因（轻链和重链）序列根据US20050118643A1中序列（轻链可变区：SEQ ID N038 ;重链可变区：SEQ ID N039 ;轻链恒定区：SEQ ID N044 ;重链恒定区：SEQ ID N045) 由上海生物工程技术服务有限公司全基因合成。抗HGF抗体的重链和轻链可变区分别与 Bevacizumab的重链和轻链基因以重叠 PCR法重组后克隆到pCHOl. 0载体中构建成真核表 达载体pCHOl. 0 (DVD-HGF/VEGF);上述质粒用脂质体法转染CHO-S细胞，并用含适当浓度的 甲氨蝶呤（MTX)和嘌呤霉素的选择培养基筛选稳定表达抗HGF/VEGF双特异性抗体的细胞 克隆。利用Protein A柱亲和层析法从细胞培养物上清中纯化抗HGF/VE