商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药生物领域，更具体地讲，涉及新的具有抗癌活性的商陆皂苷元氨 基胍衍生物Hu-17及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 商陆阜苷元（phytolaccagenin，化学名：2 β，3 β，23-三羟基-齐墩果 烷-12-烯-28-酸-30-酸甲酯）是从中药商陆中分离得到的一种活性成分，是商陆皂苷甲 (Esculentoside A，EsA)的苷元部分，而本发明中的商陆阜苷元通过酸水解商陆阜苷甲而 得到，其结构如下：
[0003]
[0004] 研宄显示，商陆皂苷甲在体外能显著抑制巨噬细胞释放IL-1、IL-6、TNF、PGE等 促炎因子，并能选择性抑制C0X-2的活性；动物实验表明，商陆皂苷甲对各种急慢性炎症的 动物模型有显著的抗炎作用（Wang Hong-Bin，et al. Mediators of inflammation 5 (4)： 292-294,1996 ；ffang Hong-Bin, et al, Mediators of Inflammation 5 (6):196,1996 ； Dianwen Ju，et al. Pharmacology 1998;鞠佃文等，药学学报 34(1) :9_12,1999;肖振宇 等，中国药理学会通讯，17(4) :32, 2000 ;肖振宇等，中国药理学会通讯，17(4) :33, 2000 ;郑 钦岳等，第二军医大学学报，22(5) :425, 2001;肖振宇等，中国药理学报，23(7) :638, 2002; ZY Xiao, et al. Int J Radiat Oncol, 65 (3) :882-889,2006 ；ffang YB1Zhang YC1Zhu ZY, et al.，Bioorg&Med Chem. (15) :2528 - 2532, 2007)。但由于商陆皂苷甲有较强的溶血作用，限 制了其作为注射药物的使用。而商陆皂苷元没有溶血作用，因而具有良好的开发前景。为 了发现商陆皂苷元的新的活性，我们对商陆皂苷元进行了结构改造。有关具有抗癌活性的 商陆皂苷元衍生物的制备，国内外未见有过报导。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的在于提供商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17。
[0006] 本发明的第二个目的在于提供商陆皂苷元氨基胍衍生物Hu-17的制备方法。
[0007] 为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：商陆皂苷元氨基胍衍生物 Hu-17,其特征在于，所述Hu-17分子式：C63H96N40 n，化学结构式如下：
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[0009] 为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：商陆皂苷元氨基胍衍生物 Hu-17的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0010] (1)商陆皂苷元活性酯中间体的制备：商陆皂苷元溶于干燥的DMF/THF中，加入 N，N-二环己基碳酰亚胺和N-羟基苯并三氮唑形成商陆皂苷元活性酯；
[0011] (2)Hu-17的合成：在步骤（1)获得的商陆皂苷元活性酯中加入硫酸氨基胍和二甲 亚砜，加热搅拌，分离纯化，即得目标产物Hu-17。
[0012] 作为一个优选方案，步骤⑴中DMF/THF的体积比为1:3。
[0013] 作为一个优选方案，步骤（2)的反应条件为氩气或者氮气保护，60-90°C，4一8小 时。
[0014] 本发明的优点在于：为提高商陆皂苷元的活性，对商陆皂苷元进行结构改造获得 商陆皂苷元C28衍生物Hu-17。C28羧基结构是其主要的活性位点，通过化学合成方法，将商 陆皂苷元衍生化，获得的化合物Hu-17具有显著的抗卵巢癌活性。
【附图说明】
[0015] 图1化合物Hu-17抑制卵巢癌细胞：A)化合物Hu-17 (1. 25 μ M、2. 5 μ M、3. 75 μ M、 5 μΜ)处理 Α2780 细胞 24、48 和 72 小时；Β)化合物 Hu-17(2. 5 μΜ、3· 75 μΜ、5 μΜ)处理 Η0-8910 细胞 24、48 和 72 小时；C)化合物 Hu-17(2. 5 μΜ、3· 75 μΜ、5 μΜ)处理 Η0-8910ΡΜ 细胞 24、48 和 72 小时；D)化合物 Hu-17(2. 5 μΜ、3· 75 μΜ、5 μΜ)处理 SK-0V-3 细胞 24、48 和72小时。MTT比色法检测细胞相对活力，计算细胞生长抑制情况。各组实验均独立重复 三次，图中数据以平均值土标准差（mean土SD)展示。
[0016] 图2化合物Hu-17能显著诱导卵巢癌细胞凋亡：A) (a)化合物Hu-17 (2.5 μ M、 3. 75 μΜ)处理Α2780和SK-0V-3细胞42小时流式细胞仪检测的Annexin V阳性细胞（统 计二四象限比例之和）的比例，（b)候选药物（3. 75μΜ、5μΜ、6. 25μΜ)处理H0-8910和 Η0-8910ΡΜ细胞48小时检测的Annexin V阳性细胞比例。Β)选取的Η0-89ΚΚΗ0-8910ΡΜ和 SK-0V-3细胞在不同药物浓度处理后的凋亡散点图，横坐标代表FITC-Annexin V，纵坐标代 表ΡΙ，红色散点（即第三象限）代表活细胞，蓝色散点（即第二象限）代表晚期凋亡的细胞， 绿色散点（即第四象限）代表早期凋亡的细胞。C)5yM候选药物（Hu-17)处理Η0-8910ΡΜ 细胞48小时线粒体跨膜电位降低的细胞比例。D)线粒体跨膜电位变化的散点图，图中横坐 标为Rhl23,纵坐标为PI，第四象限表示罗丹明123阳性细胞，一三象限表示膜电位降低的 细胞。各组实验均独立重复三次，图中数据以平均数土标准差（mean土SD)展示，组间比较 采用双侧t检验法，其中**表示P〈0. 01，***表示P〈0. 001。
[0017] 图3化合物Hu-17扰乱卵巢癌细胞周期：A) (a) A2780细胞经候选药物（2. 5 μ Μ)处 理48小时后各周期比例的柱状图。（b)H0-8910细胞经候选药物（3. 75 μΜ)处理48小时 候后各周期比例的柱状图。（c) Η0-8910ΡΜ细胞经候选药物（3.75 μ Μ)处理48小时候后各 周期比例的柱状图。Β)Α2780、Η0-8910、Η0-8910ΡΜ细胞加药前后的周期分布图，图中蓝色 部分代表处于S期的细胞，其左右两侧红色部分分别代表处于G0/G1期和G2/M期的细胞。 各组实验均独立重复三次，图中数据以平均数土标准差（mean土SD)展示，组间比较采用双 侧t检验法，其中*表示Ρ〈0· 05, **表示Ρ〈0· 01，***表示Ρ〈0· 001，ns表示无统计学显著 性差异。
[0018] 图4化合物HU-17在荷瘤小鼠上显著抑制卵巢癌细胞的生长：A)在裸鼠皮下移植 A2780细胞2周后给药（腹腔注射给药，三天两次，5mg/kg/次）并动态监测肿瘤直径，通过 公式V = l/2XaXb2计算出肿瘤体积，并得出相对肿瘤体积（RTV = Vt/V0，Vt表示实时测 量的肿瘤体积，VO表示给药前肿瘤体积），绘制肿瘤生长曲线，Candidate表示候选新药组， Control表示阴性对照组。B)给药结束3天后（Day31)，脱颈处死裸鼠，将两组瘤体剥离后 称得的瘤重。C)给药期间动态监测裸鼠体重的变化绘制成的体重变化曲线。图中数据以 平均数土标准差（mean土SD)展示，组间比较采用t检验法，其中*表示P〈0. 05, **表示 P〈0. 01，ns表示无统计学显著性差异。D)两组瘤体剥离后的照片。
[0019] 图5体外实验证实化合物Hu-17显著增强顺铂对耐药的卵巢癌细胞的生长抑制和 诱导凋亡效果：A) A2780、H0-8910、H0-8910PM和SK-0V-3细胞经10 μ M和20 μ M的顺铂处 理48小时，MTT法检测相对细胞活力。Β) Η0-8910、Η0-8910ΡΜ和SK-0V-3细胞经20 μ M顺 铂或2. 5 μΜ Hu-17单独或联合处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。OWestern blot法 检测H0-8910、H0-8910PM和SK-0V-3细胞的蛋白P53的表达。D)流式技术检测H0-8910、 H0-8910PM和SK-0V-3细胞经20 μ M顺铂或2. 5 μ M Hu-17单独或联合处理48小时后的凋亡 细胞的比例，凋亡细胞以Annexin V阳性细胞的比例显示（统计二四象限）。E)SK-0V-3细 胞在20 μ M顺铂或2. 5 μ M Hu-17处理48小时后的凋亡散点图。F) SK-0V-3细胞在2. 5 μ M Hu-17或20 μ M顺铂处理12小时后，抽提蛋白检测凋亡指示分子PARP及caspase 3的变 化。G)H0-8910细胞经200 μΜ卡铂（Carboplatin)或5 μΜ Hu-17单独或联合处理48小 时，MTT法检测相对细胞活力。H) SK-0V-3细胞经80 μ M卡铂或5 μ M Hu-17单独或联合处 理48小时，MTT法检测相对细胞活力。M表示候选新药，M+C (combination)表示候选新药 与顺钼联合使用。M+carboplatin表示候选新药与卡钼联合使用。各组实验均独立重复三 次，图中数据以平均数土标准差（mean土 SD)展示，组间比较采用双侧t检验法，其中**表 示 Ρ〈0· 01，*** 表示 Ρ〈0· 001。
[0020] 图6裸鼠体内实验显示Hu-17与顺铂联合使用显著抑制耐药的卵巢癌细胞的生 长：A)裸鼠皮下移植SK-0V-3细胞第13天开始用药，期间动态监测肿瘤大小，通过公示V = l/2XaXb2和RT