利用人副流感2型病毒载体的疫苗的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及可作为用于预防或治疗疾病的疫苗使用的RNA病毒载体及灭活疫苗。
【背景技术】
[0002] 副粘病毒科的病毒具有负单链RNA作为基因组，已制作出了能够利用逆向遗传学 方法高度表达外源基因的载体，认为其具有作为基因治疗用载体或基因重组疫苗用载体的 优异特性。由于病毒的生命周期不包含DNA期（DNA phase)，并且转录?复制全部在处于核 外的细胞质中进行，因此，与染色体DNA发生同源性重组的概率极小，由于对染色体的基因 重组而致癌的风险小。
[0003] 目前为止，本申请的发明人试图将人副流感2型病毒（其为负单链RNA病毒，属于 副粘病毒科副粘病毒亚科聰腺炎病毒（Rubulavirus)属，下文记作hPIV2)载体化，研宄了 其作为疫苗及基因治疗用载体的应用。
[0004] 在研宄过程中，构建了 F基因（病毒的结构蛋白质）完全缺失了的、hPIV2 的F基因缺失型载体。该载体具有非传播性（non-transmissible)或单轮感染性 (single-round-infectious)的特性。此外，还成功获得了具有高效价（high titer)的 载体产生能力的稳定表达F基因的包装细胞，该细胞可用于F基因缺失型载体的生产。缺 失F基因的该载体，仅能在表达有F基因的包装细胞中产生将F蛋白质保持于病毒被膜 上的感染性载体。另一方面，在不表达F基因的细胞?组织中，尽管发生所谓的自身复制 (self-replication)，但不能产生感染性的载体，因此，载体不会在受体中无穷尽地增殖， 可以认为其安全性较高（专利文献1)。
[0005] 已报道了许多使用基因重组RNA活病毒载体或弱毒化RNA重组病毒的疫苗或基 因治疗在非临床试验、临床研宄、临床试验等中显示出有效性的结果（非专利文献1~9)。 但是，目前还没有报道被美国食品药品监督管理局及欧州药品厅批准为药品的基因重组活 (live) RNA病毒载体制剂。推测其理由为：使用基因重组的活RNA病毒作为载体时，虽然采 取了利用弱毒化病毒以降低病原性、或利用非传播型载体等安全层面上的对策，但在感染 细胞内仍大量产生病毒及外源基因产物，因此不能彻底消除对恒常性（homeostasis)的影 响或外源基因的突变等的忧虑。
[0006] 因此，可以说将基因组灭活或分解为组分（component)从而使病毒不进行转 录?复制的疫苗的安全性较高。灭活疫苗的制作多采用使用福尔马林的处理方法。
[0007] 但是，被认为安全性较高的灭活疫苗也存在安全性上的问题。20世纪60年代开发 出了针对属于副粘病毒科的RSV的、利用福尔马林获得的灭活RSV疫苗，接种该疫苗后，由 于RSV的自然感染，导致婴幼儿中出现了重症患者和2名死亡者。之后全力进行了对其原因 的阐明。发现了利用福尔马林对病毒进行灭活处理导致F膜蛋白质的立体结构发生变化。 发现：通过接种该疫苗，产生的是不具有对改性后的F膜蛋白质的中和活性的抗体，而由于 经过福尔马林处理而不存在正常结构的F膜蛋白质，却没有产生对该蛋白质具有中和活性 的抗体。并且，认为在接种该疫苗后，由于RSV病毒的自然感染，使得机体反应欲要抑制病 毒的增殖时，将过量产生没有中和活性的抗体。结果，在通常的RSV感染中观察不到的那样 多数的嗜酸性粒细胞浸润至肺组织，随之IL-4、IL-5等细胞因子升高，也不能诱导局部IgA 抗体、细胞免疫，从而引起了重症化。
[0008] 此外，已知福尔马林灭活RSV使树突状细胞（其为抗原呈递细胞）成熟的能力比 活RSV差，故研宄了利用不使用福尔马林的UV处理、热处理等进行的灭活，但无论采用哪种 处理，将树突状细胞活化的能力均较低，并且还诱导炎症反应，因此未实现实用化。同样地， 对于属于副粘病毒科的麻瘆病毒的福尔马林灭活疫苗，也报道了嗜酸性粒细胞的浸润和异 型麻瘆。
[0009] 另一方面，有报道称在动物试验中设法使其能够诱导Thl型免疫的灭活RSV疫苗 具有能预防病毒感染的效果，认为能诱导Thl的灭活疫苗具有可解决上述问题的可能性。
[0010] 虽然认为由病毒载体引起的导入基因在体内的表达较高，但报道了病毒感染细 胞?组织中的导入基因的表达没有定量性或表达量低、作为基因治疗用载体的实效性不高 的例子。此外，还报道了先前存在的抗体对导入的病毒载体的表达的抑制或伴随多次的病 毒载体施予而发生的抗体对该载体的表达的抑制。在需要基因表达达到某一定量以上（即 使仅为暂时达到）的基因治疗中使用抗体诱导能力高的病毒载体的困难程度从这些报道 例可见一斑。
[0011] 向病毒载体中导入外源基因并使其表达时，由于外源基因产物不具有包装信号， 因此外源基因产物通常不被包含于载体中，病毒载体在体内施予后感染受体细胞，由此发 生转录?复制，才能产生外源基因产物。因此，病毒载体的感染、转录?复制等被中和抗体 等阻碍时，外源基因的表达将被抑制或降低。
[0012] 此外，在体内，病毒对细胞?组织的感染效率低，或者病毒即使感染也不发生转录 复制或效率非常差、外源基因几乎不表达的情况也很多。认为其原因是：在体内的感染细胞 中，病毒的转录复制被由病毒感染诱导的干扰素等抑制为较低水平，细胞外基质等使得病 毒载体无法到达靶细胞，等等。
[0013] 现有技术文献
[0014] 专利文献
[0015]专利文献 1 :W02012/108195
[0016] 非专利文献
[0017]非专利文献 1 :Vitology. 377 (2)，225 (2008)
[0018]非专利文献 2 :Virology. 362 (1)，139 (2007)
[0019]非专利文献 3 :Vitology. 16(11)，21883(2008)
[0020]非专利文献 4 :Vaccine. 28, 2771，（2010)
[0021]非专利文献 5:JVirol. 6521，（2011)
[0022]非专利文献 6:JVirol. 1089,（2002)
[0023]非专利文献 7 :Vaccine. 29, 8557,（2011)
[0024]非专利文献 8:JVirol. 584,（2009)
[0025]非专利文献 9:VetImmunolImmunopathol. 146 (1), 92 (2012)
【发明内容】
[0026] 本发明的目的在于提供能够高效地向靶细胞中导入抗原多肽（包括蛋白质和肽） 的病毒载体及灭活载体，其是作为预防或治疗疾病用的疫苗有用的副粘病毒科的病毒载 体。
[0027] 本申请的发明人发现，通过使病毒载体的结构基因与抗原蛋白质或肽的基因以融 合的方式表达，能够高效且定量地将抗原蛋白质或肽运送至靶细胞。
[0028] 此外，发明人成功构建了以下4种类型的载体：类型1)，将抗原基因配置于膜蛋白 质HN基因的3'末端侧（以下记作编码链），由此以使得抗原处于在载体被膜的外部的形式 使抗原肽表达；类型2)，将抗原基因配置于F包装细胞的F基因的3'末端侧，由此使得抗 原肽在载体被膜的内部表达；类型3)，组合上述1)和2)，由此使得抗原肽在载体被膜的内 部和外部两处均表达；以及类型4)，将抗原与作为向病毒的包装信号发挥作用的膜蛋白质 的膜?细胞内结构域融合，由此在载体上整合进抗原。由此，向多个抗原的载体中进行各种 各样的导入成为可能。
[0029] 即，本发明涉及能够将抗原多肽高效地传递至靶细胞中的病毒载体，具体而言提 供如下所述的发明：
[0030] [1]病毒载体，是在副粘病毒科病毒的基因中整合有编码抗原多肽的基因的病毒 载体，在所述病毒载体中，所述抗原多肽以与病毒的结构蛋白质或它们的一部分融合的融 合蛋白质的形式表达。
[0031] [2]如[1]所述的病毒载体，其中，融合蛋白质是与病毒的HN蛋白质、F蛋白质及 M蛋白质中的一种或两种以上或它们的一部分融合的融合蛋白质。
[0032] [3]如[1]或[2]所述的病毒载体，其特征在于，
[0033] 1)编码抗原多肽的基因配置于HN基因的3'末端侧，抗原多肽在载体被膜的外部 表达；
[0034] 2)编码抗原多肽的基因配置于F基因的3'末端侧，抗原多肽在载体被膜的内部表 达；或
[0035] 3)编码抗原多肽的基因分别配置于HN基因的3'末端侧及F基因的3'末端侧，抗 原多肽在载体被膜的外部和内部两方表达。
[0036] [4]如[1]或[2]所述的病毒载体，其特征在于，使抗原多肽与作为病毒包装信号 的F膜蛋白质或HN膜蛋白质的膜?细胞内结构域融合，将抗原多肽保持在载体被膜上。
[0037] [5]如[1]~[4]中任一项所述的病毒载体，其中，病毒为F蛋白质缺失型副粘病 毒科病毒。
[0038] [6]如[1]~[5]中任一项所述的病毒载体，其中，病毒为经核酸灭活处理的病毒。
[0039] [7]如[6]所述的病毒载体，其中，核酸灭活处理尽量不改变（不实质性地改变） 病毒被膜的结构。
[0040] [8]如[1]~[7]中任一项所述的病毒载体，其中，抗原多肽为流感病毒的M2e蛋 白质或其片段。
[0041][9]如[1]~[7]中任一项所述的病毒载体，其中，抗原多肽为选自由下述病毒 的抗原肽、下述细菌的抗原肽、或RSV的F蛋白质、癌抗原gplOO、MUC1、NY-ESO-1、MelanA/ MARTI、TRP2、MAGE、CEA、CA125、HER2/neu、WT1 及 PSA 组成的组中的任一种或两种以上、 或它们的片段，所述病毒选自包括强毒型流感病毒在内的流感病毒、副流感3型病毒、 RS病毒、亨德拉病毒（Hendravirus)、SARS病毒、尼帕病毒（Nipahvirus)、拉沙病毒 (Lassavirus)、登革病毒（Denguevirus)、西尼罗病毒（WestNilevirus)、人偏肺病毒 (humanmetapneumovirus)、埃博拉病毒（Ebolavirus)、汉坦病毒（Hantavirus)、艾滋病 病毒、C型肝炎病毒、拉沙病毒、人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus)、风瘆病毒、轮状 病毒（Rotavirus)、诺如病毒（Norovirus)、刚果-克里米亚出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagicfevervirus)、疱疼病毒（herpesvirus)、巨细胞病毒（cytomegalovirus) 及乳头瘤病毒（papillomavirus)，所述细菌选自A组|3型溶血性链球菌、结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis)、霍乱弧菌及支原体。
[0042] [10]制造副粘病毒科的病毒载体的方法，所述病毒载体以与病毒的结构蛋白质或 它们的一部分融合的融合蛋白质的形式表达抗原多肽，所述方法包括下述各工序：
[0043] 将在病毒基因中整合有编码融合蛋白质的基因的副粘病毒科的病毒与Vero细胞 共培养；
[0044] 然后从培养上清液中分尚病毒颗粒。
[0045] [11]如[10]所述的方法，其中，融合蛋白质为与病毒的HN蛋白质、F蛋白质及M 蛋白质中的一种或两种以上或它们的一部分融合的融合蛋白质。
[0046] [12]如[10]或[11]所述的方法，融合蛋白质为选自病毒的HN蛋白质或F蛋白质 的细胞内区域中的融合蛋白质。
[0047] [13]如[10]~[12]中任一项所述的方法，其特征在于，抗原多肽如下进行表达，
[0048] 1)以融合于HN蛋白质的C末端侧的方式在载体被膜的外部表达，
[0049] 2)以融合于F蛋白质的N或C末端侧或HN蛋白质的N末端侧的方式在载体被膜 的内部表达，或
[0050] 3)以分别融合于HN蛋白质的C末端侧及F蛋白质的N或C末端侧或HN蛋白质的 N末端侧的方式在载体被膜的外部和内部两方表达。
[0051] [14]如[10]~[12]中任一项所述的方法，其特征在于，抗原多肽与病毒的HN蛋 白质或F蛋白质的膜?细胞内区域融合，抗原多肽被包含于载体被膜上。
[0052] [15]如[10]~[14]中任一项所述的方法，包括下述工序：
[0053] 将缺失