用于制备纯化的多肽组合物的方法
【专利说明】用于制备纯化的多肽组合物的方法
[0001] 本申请是申请日为2009年9月22日、申请号为200980142517. 1、发明名称为"用 于制备纯化的多肽组合物的方法"的中国发明专利申请的分案申请。
[0002] 交叉引用
[0003] 本申请要求2008年9月22日提交的美国临时申请No. 61/099,099的权益，该申 请以引用方式合并于此。
【背景技术】
[0004] 肽在生物过程中是重要的。例如，肽可作为激素、酶抑制剂、底物、神经递质、神经 介质以及发挥许多其他功能。肽可以与受体或酶结合并因此影响细胞间通讯和控制重要的 细胞功能，例如代谢、免疫防御和繁殖（Babine等，Chem. Rev. 1997,97,1359)。因此，肽在药 物化学中用作治疗剂以及在药物应用中的受到关注。
[0005] 使用未修饰的肽作为治疗剂和药剂受到若干因素的限制。这些限制包括差的 代谢稳定性如对肽酶降解的敏感性、差的细胞渗透性和由于构象柔性而缺乏结合特异 性。已经描述了改善这些限制特性的尝试，包括通过各种方法产生环肽和拟肽，所述方 法包括二硫键形成、酰胺键形成和碳碳键形成（Jackson等（1991)，J. Am. Chem. Soc. 113 : 9391-9392 ;Phelan 等（1997)，J.Am. Chem. Soc. 119 :455-460 ;Taylor(2002)，Biopolymers 66 :49-75 ;Brunel 等（2005)，Chem. Commun. (20) :2552-2554 ;Hiroshige 等（1995)，工八111· Chem. Soc. 117 :11590-11591 ;Blackwell 等（1998)，Angew.Chem. Int. Ed. 37 :3281-3284 ; Schafmeister 等（2000)，J. Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892)。这些方法仍然受到一些因素 的限制，包括差的代谢稳定性（二硫键和酰胺键）、差的细胞渗透性（二硫键和酰胺键）以 及潜在毒性金属的使用（用于碳碳键形成）。尤其是，毒性金属杂质的存在可能对经由需 要这种金属（例如以催化剂形式）的化学反应制备得到的多肽药物的临床使用形成重大挑 战。因此，需要纯化拟肽化合物的方法和通过这类方法产生的纯组合物。
[0006] 发明简述
[0007] 本发明旨在满足这些和其他需要。在一个方面，本发明提供一种制备纯化的拟肽 大环化合物的组合物。在一个实施方式中，该方法包括接触拟肽前体并纯化粗制的拟肽大 环化合物以产生纯化的拟肽大环化合物组合物。在该实施方式中，所述拟肽前体可含有至 少两个能够与复分解催化剂进行复分解反应的部分，以制备粗的拟肽大环化合物。
[0008] 根据本发明公开的方法纯化的拟肽大环化合物组合物可包含金属。在一个实施方 式中，所述组合物含有小于约75、20、10、5或Ippm重量的金属。在另一个实施方式中，纯化 的拟肽大环化合物组合物含有可安全给药予受试者（例如人类受试者）的金属浓度。
[0009] 本发明也提供含有拟肽大环化合物（其含有将第一氨基酸连接至第二氨基酸的 交联连接体）和浓度为约〇. 5ppm至约1、5、10、20或75ppm重量的金属的组合物。在一个 实施方式中，该组合物包含含有将第一氨基酸连接至第二氨基酸的交联连接体的拟肽大环 化合物，其中所述氨基酸中的至少一个是α，α-二取代氨基酸，且进一步其中所述组合物 的金属浓度小于约1、5、10、20或75ppm重量。在相关实施方式中，所述组合物包含交联连 接体，其中所述第一氨基酸是α，α-二取代的。在另一个相关实施方式中，所述组合物包 含交联连接体，其中第二氨基酸是α，α-二取代的。
[0010] 在一些实施方式中，所述拟肽大环化合物含有螺旋、α -螺旋、BCL-2家族成员的 α -螺旋结构域、或ΒΗ3结构域。该拟肽大环化合物可以与表1、2、3或4中的肽序列同源。 在一个实施方式中，该拟肽大环化合物与表1中序列之间的同源性可以是至少60%或至少 80%〇
[0011] 拟肽大环化合物优选包括将第一氨基酸连接到第二氨基酸的交联连接体。在一个 实施方式中，所述第一氨基酸和第二氨基酸通过三个氨基酸分隔。在另一个实施方式中，所 述第一氨基酸和第二氨基酸通过六个氨基酸分隔。
[0012] 在一个实施方式中，所述交联连接体包含6至14个连续的键。在另一个实施方式 中，所述交联连接体包含8至16个连续的键。在另一个实施方式中，所述交联连接体包含 8至12个连续的键。在另一个实施方式中，所述交联连接体包含10至13个连续的键。
[0013] 所述拟肽大环化合物优选包含螺旋结构。该螺旋结构可以含有一圈或多圈的 α -螺旋。例如，该交联连接体可包括含有1圈、2圈或更多圈的α -螺旋。在一个实施方 式中，该交联连接体跨越α -螺旋的1到5圈。在另一个实施方式中，所述交联连接体的长 度为α-螺旋的每一圈约5Α到约9Α。
[0014] 在交联连接体的一个方面，第一氨基酸或第二氨基酸的α位可被取代。在一个实 施方式中，第一氨基酸的α位被另外取代。在另一个实施方式中，第二氨基酸的α位被另 外取代。
[0015] 在一个实施方式中，所述拟肽大环化合物含有约18个原子到约26个原子的环。在 另一个实施方式中，所述拟肽大环化合物含有约29个原子到约37个原子的环。
[0016] 所述拟肽大环化合物可以在比用该拟肽大环化合物治疗的受试者的生理pH低或 高5 %的pH下带净正电荷。在一个实施方式中，所述拟肽大环化合物在约7. 4的pH下可以 带净正电荷。
[0017] 所述拟肽大环化合物可以包含含有一个或多个卤素、烷基、荧光部分、亲和标记、 靶向部分或放射性同位素的部分。
[0018] 所述拟肽大环化合物可用作治疗剂。在一个实施方式中，本发明拟肽大环化合物 以用于治疗癌症的治疗剂提供。在另一个实施方式中，本发明拟肽大环化合物以处于临床 试验评估中的治疗剂提供。
[0019] 本发明的拟肽大环化合物组合物可以含有金属。用于合成拟肽大环化合物组合物 的金属的浓度和种类可以改变。用于本发明的金属浓度（按重量计算）的非限制性的例子 包括小于约lppm、小于约2ppm、小于约2. 5ppm、约0· 5ppm、约lppm、约lOppm、约1到约5、 10、20、75??111、或约0.5到约5、10、20或75口口111。
[0020] 在一个方面，拟肽大环化合物的金属是钌或锇。在一个实施方式中，该组合物含 有的钌总浓度小于约1、5、10、20或75ppm重量。在另一个实施方式中，该组合物含有的钌 总浓度为约〇. 5ppm到约5、10、20或75ppm重量。
[0021] 本发明使用一种或多种复分解反应以制备拟肽大环化合物。在一个实施方式中， 复分解催化剂包含钌或锇催化剂。在相关实施方式中，该复分解催化剂包含一个或多个取 代基，其是碘、溴、氯、苯基、碳烯、环己基、膦、三环己基膦、咪唑或苯亚甲基。在一个实施方 式中，该复分解催化剂结合到固体载体上。
[0022] 本发明拟肽大环化合物组合物可包含赋形剂。在一个实施方式中，该拟肽大环化 合物还含有药学可接受的载体。该拟肽大环化合物组合物可以在有或没有溶剂的情况下以 多种形式存在，例如粉末、盐、液体或冻干形式。在一个实施方式中，该拟肽大环化合物组合 物包括拟肽大环化合物的药学可接受的盐。该拟肽的药学可接受盐可以包括例如盐酸盐或 醋酸盐。
[0023] 以引用方式的合并
[0024] 本说明书提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用合并于此，如同具体并单 独地指出各单个的出版物、专利和专利申请通过引用合并一样。
[0025] 发明详述
[0026] 定义
[0027] 如本文所使用，术语"大环化合物"指的是具有包括由至少9个共价结合的原子形 成的环或环形的化学结构的分子。
[0028] 如本文所使用，术语"拟肽大环化合物"或"交联多肽"指的是含有由多个肽键连接 的多个氨基酸残基和至少一个大环形成连接体（或者"交联连接体"）的化合物，该大环形 成连接体在相同分子内的第一天然存在或非天然存在的氨基酸残基（或类似物）和第二天 然存在或非天然存在的氨基酸残基（或类似物）之间形成大环。拟肽大环化合物包括其中 大环形成连接体将第一氨基酸残基（或者类似物）的α碳连接到第二氨基酸残基（或者类 似物）的α碳上的实施方式。所述拟肽大环化合物任选地包括一个或多个氨基酸残基和 /或氨基酸类似物残基之间的一个或多个非肽键，并且除了形成大环的任何残基之外，任选 地包括一个或多个非天然存在的氨基酸残基或氨基酸类似物残基。
[0029] 如本文所使用，术语"稳定性"指的是通过由圆二色光谱、NMR或其他生物物理学测 量测得的本发明拟肽大环化合物在溶液中维持特定的二级结构，或在体外或体内对蛋白水 解降解的抗性。本发明预期的二级结构的非限制性例子是α-螺旋、β-转角和β-折叠 片。
[0030] 如本文所使用，术语"螺旋稳定性"指的是通过由圆二色光谱或NMR测得的本发明 拟肽大环化合物维持α螺旋结构。例如，在一些实施方式中，相比于缺少R-取代基的相 应大环化合物，由圆二色光谱测定的本发明拟肽大环化合物的α -螺旋度显示至少1. 25、 1.5、1.75或2倍的增加。
[0031] 术语" α -氨基酸"或简称为"氨基酸"指的是含有与被称为α -碳的碳结合的氨 基和羧基的分子。适当的氨基酸包括但不限于：天然存在的氨基酸的D和L-异构体以及由 有机合成或其他代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。除非上下文另外指出，本文使用的 术语氨基酸用来包括氨基酸类似物。
[0032] 术语"天然存在的氨基酸"指的是通常在天然合成的肽中发现的二十种氨基酸中 的任何一种，单字母缩写为 A、R、N、C、D、Q、E、G、Η、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y 和 V。
[0033] 术语"氨基酸类似物"或"非天然氨基酸"指的是结构上类似于氨基酸且可以代替 氨基酸形成拟肽大环化合物的分子。氨基酸类似物包括但不限于：除了在氨基和羧基之间 包含一个或多个额外的亚甲基（例如，α-氨基β-羧酸），或用相似的反应性基团替代氨 基或羧基（例如，用仲胺或叔胺替代伯胺，或用酯替代羧基），结构上和本发明定义的氨基 酸相同的化合物。
[0034] "非必需的"氨基酸残基是可以由多肽（例如，BH3结构域或p53MDM2结合结构域） 的野生型序列发生改变，而不消除或实质改变其基本生物学或生物化学活性（例如，受体 结合或活化）的残基。"必需的"氨基酸残基是，当由多肽的野生型序列发生改变时，导致多 肽的主要生物学或生物化学活性消除或基本上消除的残基。
[0035] "保守的氨基酸置换"是用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的氨基酸 置换。现有技术已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链 (例如，K、R、H)、酸性侧链（例如，D、E)、不带电的极性侧链（例如，G、N、Q、S、T、Y、C)、非极 性侧链（例如，A、V、L、I、P、F、M、W)、β-分支侧链（例如，T、V、I)和芳香族侧链（例如， Y、F、W、H)的氨基酸。因此，例如，BH3多肽中的预计的非必需氨基酸残基优选被来自相同 侧链家族的另一个氨基酸残基替代。可接受的置换的其他例子是基于电子等排考虑（例如 正亮氨酸替代甲硫氨酸）或其他性质（例如2-噻吩丙氨酸替代苯丙氨酸）的置换。
[0036] 本文使用的与大环化合物或大环形成连接体结合的术语"元"指的是形成或者可 以形成大环的原子，排除取代基或侧链原子。以此类推，环癸烷、1，2_二氟-环癸烷和1， 3-二甲基环癸烷都被认为是十元大环化合物，因为氢或氟取代基或甲基侧链不参与形成大 环。
[0037] 符号《/%，当用作分子结构的一部分时指的是单键或反式或顺式双键。
[0038] 术语"氨基酸侧链"指的是连接于氨基酸的α -碳的部分。例如，丙氨酸的氨基酸 侧链是甲基，苯丙氨酸的氨基酸侧链是苯甲基，半胱氨酸的氨基酸侧链是硫代甲基，天冬氨 酸的氨基酸侧链是羧甲基，酪氨酸的氨基酸侧链是4-羟苯甲基，等等。也包括其他非天然 存在的氨基酸侧链，例如，存在于自然界中的那些（例如，氨基酸代谢物）或通过合成制备 的那些（例如，α，α -二取代氨基酸）。
[0039] 术语" α，α -二取代氨基酸"指的是含有与连接于两个天然或非天然氨基酸侧链 的碳（α -碳）的氨基和羧基的分子或部分。
[0040] 术语"多肽"包括两个或更多个通过共价键（例如酰胺键）连接的天然或非天然 存在的氨基酸。本文描述的多肽包括全长蛋白质（例如，完全加工的蛋白质）以及较短的 氨基酸序列（例如，天然存在的蛋白质片段或合成的多肽片段）。
[0041] 本文所使用的术语"大环化试剂"或"大环形成试剂"指的是可以通过介导两个反 应性基团之间的反应来制备本发明拟肽大环化合物的任何试剂。反应性基团可以是例如 末端烯类。在这种实施方式中，大环化试剂或大环化试剂是复分解催化剂，包括但不限于： 稳定的后过渡金属碳烯络合催化剂，例如第VIII族过渡金属碳烯催化剂。例如，这样的催 化剂是具有+2氧化态、电子数16和五配位的钌和锇金属中心。其他的催化剂公开在Grubbs 等，"Ring Closing Metathesis and Related Processes in Organic Synthesis" Acc. Chem. Res. 1995, 28,446-452、美国专利 No. 5, 811，515、美国专利 No. 6, 111, 121 和美国专利 No. 6, 921，735中。在再其他的例子中，反应性基团是硫醇基。在这种实施方式中，大环环试 剂例如是用两个硫醇反应性基团（例如卤素基团）官能化的连接体。
[0042] 术语"齒"或"卤素"指的是氟、氯、溴或碘或其根。
[0043] 术语"烷基"指的是包含指定数目碳原子的直链或支链烃链。例如，C1-C ltl表示其 中具有1到10 (包含）个碳原子的基团。在没有指定任何数字的情况下，"烷基"是其中具 有1到20 (包含）个碳原子的链（直链或支链）。
[0044] 术语"亚烷基"指的是二价烷基（即-R-)。
[0045] 术语"链烯基"指的是具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链的烃链。链烯基 部分包含指定数目的碳原子。例如，C2-Cltl表示其中具有2到10(包含）个碳原子的基团。 术语"低级链烯基"指的是(：2-(：6链烯基链。在没有指定任何数字的情况下，"链烯基"是其 中具有2到20 (包含）个碳原子的链（直链或支链）。
[0046] 术语"炔基"指的是具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链的烃链。炔基部分 包含指定数目的碳原子。例如,C2-Cltl表示其中具有2到10(包含）个碳原子的基团。术语 "低级炔基"指的是C2-C6炔基链。在没有指定任何数字的情况下，"炔基"是其中具有2到 20 (包含）个碳原子的链（直链或支链）。
[0047] 术语"芳基"指的是6-碳单环或10-碳二环的芳环系统，其中各环的0、1、2、3或4 个原子被取代基取代。芳基的例子包括苯基、萘基等等。术语"芳基烷基"或术语"芳烷基" 指的是被芳基取代的烷基。术语"芳基烷氧基"指的是被芳基取代的烷氧基。
[0048] "烷基芳基"指的是其中芳基的一个氢原子被如上定义的C1-C5烷基取代的如上定 义的芳基。烷基芳基的典型例子包括但不限于：2-甲基苯基、3-甲基苯基、4-甲基苯基、 2- 乙基苯基、3-乙基苯基、4-乙基苯基、2-丙基苯基、3-丙基苯基、4-丙基苯基、2- 丁基苯 基、3_ 丁基苯基、4_ 丁基苯基、2_戊基苯基、3_戊基苯基、4_戊基苯基、2_异丙基苯基、3_异 丙基苯基、4-异丙基苯基、2-异丁基苯基、3-异丁基苯基、4 -异丁基苯基、2-仲丁基苯基、 3- 仲丁基苯基、4-仲丁基苯基、2-叔丁基苯基、3-叔丁基苯基和4-叔丁基苯基。
[0049] "酰胺基芳基"指的是其中芳基的一个氢原子被一个或多个-C(O)NH2基团取代的 如上定义的芳基。酰胺基芳基的典型例子包括2-C(O)NH2-苯基、3-C(O)NH2-苯基、4-C(0) NH2-苯基、2-C (O)NH2-吡啶基、3-C (O)NH2-吡啶基和4-以0)順2吡啶基。
[0050] "杂环基烷基"指的是其中C1-C5烷基的一个氢原子被杂环取代的如上定义的C ^C5烷基。杂环基烷基的典型例子包括但不限于！-CH2CH2-吗啉、-CH2CH 2-哌啶、-CH2CH2CH2-吗 啉和-CH2CH2CH2-咪唑。
[0051] "酰胺基烷基"指的是其中C1-C5烷基的一个氢原子被-C(O)NH 2取代的如上 定义的C1-C5烷基。酰胺基烷基的典型例子包括但不限于：-CH 2-C (0) NH2、-CH2CH2-C (0) NH2、-CH2CH2CH2C (O)NH2、-CH2CH2CH2CH 2C (O)NH2、-CH2CH2CH2CH 2CH2C (O)NH2、-CH2CH(C(O)NH2) CH3、-CH2CH (C (0) NH2) CH2CH3、-CH (C (0) NH2) CH2CH3、-C (CH3) 2CH2C (0) NH2、-CH2-CH2-NH-C (0) -CH 3、-CH2-CH2-NH-C (0)-CH3-CH3 和-CH2-CH2-NH-C(O)-CH = CH2。
[0052] "羟烷基"指的是其中C1-C5烷基的一个氢原子被羟基取代的如上定义的C i-Cjl 基。羟烷基基团的典型例子包括但不限于：_CH20H、-CH2CH20H、-CH 2CH2CH20H、-CH2CH2CH 2CH2OH 、-CH2CH2CH2CH2CH20H、-CH 2CH (OH) CH3、-CH2CH (OH) CH2CH3、-CH (OH) CH3和-C (CH 3) 2CH20H〇
[0053] "羧基烷基"指的是其中C1-C5烷基的一个氢原子被-COOH取代的如上定义的C「C 5烷基。羧基烷基的典型例子包括但不限于：-CH2C00H、-CH2CH2C00H、_CH 2CH2CH2C00H、-CH2CH2CH2CH2COOH, -CH2CH(COOH) CH3> -CH2CH2CH2CH2CH2C00H, -CH2CH(COOH) CH2CH3, -CH(COOH) CH2CH3和-C(CH3)2CH2C00H。
[0054] 本文使用的术语"环烷基"包括饱和的和部分未饱和的环烃基团，其含有3到12个 碳，优选3到8个碳，更优选3到6个碳，其中环烷基基团还可任选地被取代。一些环烷基 包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。
[0055] 术语"杂芳基"指的是芳香族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环的环系统， 如果是单环，含有1-3个杂原子，如果是二环，含有1-6个杂原子，或如果是三环，含有1-9 个杂原子，所述杂原子选自〇、N或S (例如，如果是单环、二环或三环，分别为碳原子和1-3、 1-6或1-9个0、N或S的杂原子），其中各环的0、1、2、3或4个原子被取代基取代。杂芳基 的例子包括吡啶基、呋喃基（furyl)或呋喃基（furanyl)、咪唑基、苯并咪唑基、嘧