新型抗原结合蛋白及其作为定位产品用于治疗癌症的用图

新型抗原结合蛋白及其作为定位产品用于治疗癌症的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及能够结合蛋白Axl的新型抗原结合蛋白，尤其是单克隆抗体，以及编 码所述蛋白的氨基酸和核酸序列。根据一个方面，本发明涉及能够结合Axl并通过诱导Axl 的内在化而被内在化到细胞中的新型抗原结合蛋白或抗原结合片段。本发明还包括所述抗 原结合蛋白作为缀合有其它抗癌化合物（如毒素、放射性元素或药物）的定位产品的用途， 及其用于治疗某些癌症的用途。
【背景技术】
[0002] "Axl"（也称为"Ufo"、"Ark"或"Tyro7"）克隆自患有慢性粒细胞白血病的患者， 当由鼠 NIH3T3过度表达时，作为致癌基因而引发转化。其属于受体酪氨酸激酶（RTK)家 族，称为 TAM(Tyro3、Axl、Mer)家族，其包括 Tyro3(Rse、Sky、Dtk、Etk、Brt、Tif)、Axl 以及 Mer (Eyk、Nyk、Tyro_12) (Lemke G.等人 Nat. Rev. Immunol. (2008)8,327-336)。
[0003] 人蛋白Axl是894个氨基酸的蛋白质，其序列呈现于SEQ ID NO. 29所列的序列中。 氨基酸1-25对应着信号肽，不含所述信号肽的人蛋白Axl呈现于SEQ ID NO. 30所列的序 列中。
[0004] Gas6最初作为生长停滞特异性基因而被分离，是TAM家族成员的常见配体 (Varnum B. C.等人Nature (1995). 373, 623-626) Aas6呈现出对Axl最高的亲和性，其次是 Tyro3,最后是Mer(Nagata K等人 J. Biol. Chem. (1996). 271，30022-30027) Jas6 由如下组 成：介导对磷脂膜结合的富含γ_羧基谷氨酸（Gla)的结构域、4个表皮生长因子样结构域 以及 2 个层粘连蛋白 G样（LG)结构域（Manfioletti G·，Brancolini, C, Avanzi, G.&Schnei der, C. Mol. Cell Biol. (1993) 13,4976-4985)。对于许多其它RTK，配体的结合导致受体二 聚化和酪氨酸残基的自身磷酸化（对于受体Axl而言，酪氨酸残基779、821和866)，其作为 各种细胞内信号传导分子的停靠位点（!^叩611?.]\1，1(6&1:;[叩，六.1(.3&印，!1.3.&6四11&111，0· K. Adv. Cancer Res. (2008). 100, 35-83)。此外，Axl受体可通过配体非依赖性过程被激活。 当Axl受体过度表达时，可发生这种激活。
[0005] Gas6/Axl信号传导已被证明调节各种细胞过程，包括大量各种细胞的体外细胞增 殖、黏附、迀移和存活（Hafizi S. &Dahlback, FEBS (2006). 273, 5231-5244)。此外，TAM 受体参与先天免疫的控制；它们抑制树突细胞（DC)和巨噬细胞中对病原体的炎症反应。它 们还驱动凋亡细胞被这些免疫细胞的吞噬作用，且其是自然杀伤（NK)细胞的成熟和杀伤 活性所需要的（Lemke G.等人 Nat. Rev. Immunol. (2008) .8, 327-336)。
[0006] 其在正常细胞中弱表达，且主要见于成纤维细胞、髓系祖细胞、巨噬细胞、神经组 织、心肌和骨骼肌中，在其中主要支持细胞的存活。Gas6/Axl系统通过调节血管平滑肌细 胞的动态平衡在血管生物学中发挥重要作用（Korshunov, V. A.，Mohan, A. M.，Georger, M. A. &Berk, B. C. Circ. Res. (2006). 98, 1446-1452 ；Korshunov, V. A. , Daul, M. , Massett, M. P. &Berk, B. C. Hypertension(2007) · 50, 1057-1062)〇
[0007] 在肿瘤细胞中，Axl在调节细胞的侵袭和迀移中起重要作用。Axl的过度表达 不仅与预后不良相关，也与乳腺、结肠、食管癌、肝细胞、胃、胶质瘤、肺、黑色素瘤、骨肉 瘤、卵巢、前列腺、横纹肌肉瘤、肾、甲状腺和子宫内膜癌中所报告的各种人类癌症的侵 袭性增加相关（Linger R. M.，Keating, A. K.，Earp, H. S. &Graham, D. K. Adv. Cancer Res. (2008) · 100, 35-83 以及 Verma A. Mol. Cancer Ther. (2011) · 10, 1763-1773,综述）。在乳癌 中，Axl似乎是上皮至间质转化（EMT)强大的效应因子；EMT过程积极促进生物体中癌细胞 的迀移和传播（Thiery J. P. Curr. Opin. Cell Biol. (2003). 15, 740-746) 〇
[0008] 也已表明Axl调节血管生成。在内皮细胞中敲除Axl确实损伤管的形成和迀移 (Holland S.J.等人Cancer Res. (2005).65,9294-9303)以及干扰特定的血管生成信号传 导通路（Li Y.等人 Oncogene (2009) · 28, 3442-3455)。
[0009] 最近对一系列细胞模型的一些研宄描述了 Axl过度表达在耐药现象中的参与。下 表1总结了这些研宄。
[0010] 轰1
[0012] 上表1中引用的完整文献如下：
[0013] -Macleod K 等人 Cancer Res. (2005) · 65, 6789-6800
[0014] -Mahadevan D 等人 Oncogene (2007) · 26, 3909-3919
[0015] -Lay J. D 等人 Cancer Res. (2007) · 67, 3878-3887
[0016] -Hong C. C 等人 Cancer Lett. (2008) · 268, 314-324
[0017] -Liu L 等人 Cancer Res. (2009).69,6871-6878
[0018] -Keating A. K.等人 Mol. CancerTher. (2010) · 9, 1298-1307
[0019] -Ye X.等人 Oncogene (2010) · 29, 5254-5264
[0020] 在这些内容中，Axl RTK被视为肿瘤学中的兴趣靶标。一些小组已经开发了使用 裸单克隆抗体或革G标小分子的革El向gas6/Axl轴的抗肿瘤策略（Verma A. Mol. Cancer Ther. (2011). 10, 1763-1773)。

【发明内容】

[0021] 在第一实施方式中，本发明涉及抗原结合蛋白、或其抗原结合片段，其i)结合人 蛋白Axl、以及ii)结合所述人蛋白Axl之后被内在化。
[0022] 更一般地，本发明涉及蛋白Axl用于选择抗原结合蛋白、或其抗原结合片段的用 途，其中抗原结合蛋白、或其抗原结合片段能够在结合所述靶标Axl之后被内在化。更具体 地，所述祀标是Axl的细胞外结构域。
[0023] 在这个具体方面，因此本发明涉及一种用于筛选化合物、或其结合片段的体外方 法，所述化合物、或其结合片段能够将兴趣分子递送或内在化至哺乳动物细胞，所述兴趣分 子被共价连接到所述化合物，其中所述方法包括以下步骤：
[0024] a)选择能够结合Axl蛋白、或其细胞外结构域（ECD)、或其表位的化合物；
[0025] b)任选地，将所述兴趣分子或对照分子共价连接至步骤a)中选择的所述化合物 以形成复合物；
[0026] c)使步骤a)中选择的所述化合物或步骤b)中获得的所述复合物接触在其表面上 表达Axl蛋白或其功能片段的哺乳动物细胞，优选活细胞；
[0027] d)确定所述化合物或所述兴趣分子或所述复合物是否已被细胞内递送或内在化 至所述哺乳动物细胞中；以及
[0028] e)选择所述化合物作为能够将兴趣分子递送或内在化至活哺乳动物细胞的化合 物。
[0029] 在一个优选的实施方式中，能够将兴趣分子递送或内在化至活哺乳动物细胞的所 述化合物是蛋白（此处也指多肽或肽）或含有肽结构的蛋白样化合物，特别是至少5、10、15 或更多氨基酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸残基可以被糖基化。
[0030] 当能够将兴趣分子递送或内在化至活哺乳动物细胞的所述化合物是蛋白或蛋白 样化合物时，所述化合物此处也被称为"抗原结合蛋白"，所述抗原结合蛋白或其结合片段 可以：
[0031 ] _i)结合蛋白Axl，优选人Axl蛋白，以及
[0032] _ii)当所述Axl蛋白表达在所述哺乳动物细胞表面时，结合所述蛋白Axl之后被 内在化至哺乳动物细胞中。
[0033] 在一个优选的实施方式中，所述哺乳动物活细胞是人细胞，优选天然表达Axl蛋 白受体的细胞。
[0034] 在一个【具体实施方式】中，步骤c)中的哺乳动物活细胞是在其表面表达重组Axl蛋 白的哺乳动物细胞。
[0035] 在又一个优选的实施方式中，所述兴趣分子是细胞毒性分子（在此处也称为细胞 毒性剂或细胞抑制剂）。
[0036] 在又一个优选的实施方式中，使用接头，更优选肽接头，更优选可切割的肽接头， 更优选可被哺乳动物细胞中（特别是所述哺乳动物细胞的细胞质中）所包含的天然细胞内 化合物切割的接头，将所述兴趣分子共价连接到能够结合Axl蛋白的所述化合物。
[0037] 在又一个优选的实施方式中，所述能够结合Axl蛋白的化合物是针对Axl蛋白、或 针对其位于Axl EDC结构域中的表位的抗体、或其结合片段。
[0038] 可通过本领域技术人员已知的用于评价细胞内递送或内在化的任何方法实现e) 的选择步骤。能够证明或评价能够特异性结合Axl蛋白的所述化合物、或所述化合物和所 述兴趣分子形成的所述复合物、或共价连接至所述化合物的所述兴趣分子的存在、不存在、 或活性的分析或测试，是技术人员熟知的（参见，此后公开的这种测试或分析的一些实例， 这些测试不限于下面这些测试的实例）。
[0039] 更具体地，可以通过FACS、免疫荧光、流式细胞术、Western印迹、细胞毒性/细胞 抑制评价等实现这些测试或分析。
[0040] 在这方面，本发明还涉及一种用于制备细胞毒性或细胞抑制性复合物的体外方 法，所述细胞毒性或细胞抑制性复合物能够将细胞毒性化合物递送至哺乳动物细胞中，优 选活细胞，所述方法包括步骤：
[0041] -将细胞毒性剂共价连接至如下的化合物：
[0042] _i)能够结合Axl蛋白，优选人Axl蛋白的化合物，以及
[0043] _ii)当所述Axl蛋白表达在所述哺乳动物细胞表面时，结合所述蛋白Axl之后被 内在化至哺乳动物细胞中的化合物。
[0044] 优选地，所述化合物是蛋白样蛋白，更优选是针对Axl蛋白、或针对位于Axl EDC 结构域中的其表位的抗体、或所述抗体的功能结合片段。
[0045] 在优选的实施方式中，使用接头，更优选肽接头，更优选可切割的肽接头，更优选 可被作为非限制性实例的天然细胞内化合物切割的接头，将所述细胞毒性剂共价连接到所 述抗Axl抗体或其功能片段。
[0046] 像TAM家族的其它成员，Axl细胞外结构域（E⑶）具有与细胞粘附分子结构接近 的结构。Axl ECD特征是两个免疫球蛋白样结构域的组合，紧接着是两个相邻III型纤连蛋 白-样结构域（O'Bryan J.P·等人，Mol. Cell Biol. (1991) .11，5016-5031)。两个 N 端免 疫球蛋白样结构域足以结合Gas6配体（Sasaki T等人，EMBO J. (2006). 25, 80-87)。
[0047] 人蛋白Axl的E⑶是451个氨基酸的片段，对应着序列SEQ ID NO. 29的氨基酸 1-451，其序列作为SEQ ID NO. 31表示在序列表中。氨基酸1-25对应着信号肽，不含信号 肽的人蛋白Axl的ECD对应着序列SEQ ID NO. 29的氨基酸26-451，由序列SEQ ID NO. 32 表不。
[0048] 迄今为止已经鉴定了不同的内在化模式。其在细胞中指导形成内在化的蛋白或蛋 白复合物。内吞后，大部分膜蛋白或脂质返回到细胞表面（循环），但有些膜成分被递送至 晚期胞内体（late endosome)或高尔基体（Maxfield F. R. &McGraw, T. E. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2004). 5, 121-132)〇
[0049] 在优选的实施方式中，本发明涉及抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其i)结合人 蛋白Axl、以及ii)结合所述人蛋白Axl之后被内在化。
[0050] 在最优选的实施方式中，本发明涉及一种抗原结合蛋白或其抗原结合片段，其
[0051] i)结合人蛋白Axl，优选具有序列SEQ ID NO. 29或30或其天然变体序列，以及
[0052] ii)结合所述人蛋白Axl之后被内在化。
[0053] "结合蛋白"或"抗原结合蛋白"是指与另一蛋白或分子（通常称为抗原）具有特 异或一般亲和性的肽链。当可能结合时，蛋白接触并形成复合物。本发明的抗原结合蛋白 可优选但不限于抗体；抗体、蛋白或肽的片段或衍生物。
[0054] 根据本发明的抗原结合蛋白的"抗原结合片段"，意在表示保留了抗原结合蛋白的 特异性结合靶标（通常也称为抗原）的能力，以及包含抗原结合蛋白氨基酸序列的至少5 个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续 氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸 残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少连续的80个氨基酸残 基、至少连续的90个氨基酸残基、至少连续的100个氨基酸残基、至少连续的125个氨基酸 残基、至少150个连续氨基酸残基、至少连续的175个氨基酸残基、至少连续的200个氨基 酸残基、或至少连续的250个氨基酸残基的氨基酸序列的任何肽、多肽或蛋白。
[0055] 在优选的实施方式中，其中抗原结合蛋白是抗体，这样的"抗原结合片段"选自Fv、 scFv(sc表示单链）、Fab、F(ab'）2、Fab'、scFv-Fc片段或双特异抗体、或通过化学修饰， 如添加聚（亚烷基）二醇如聚乙二醇（"聚乙二醇化"）（聚乙二醇化片段被称为Fv-PEG、 scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab'）22-PEG 或 Fab' -PEG) ( "PEG"表示聚乙二醇）、或通过并入脂质 体中来延长其半衰期的任意片段，所述片段具有根据本发明抗体的特征性CDR中的至少一 个。优选地，所述"抗原结合片段"将由其所源自的抗体的可变重链或可变轻链的部分序列 构成或包括其所源自的抗体的可变重链或可变轻链的部分序列，所述部分序列足以保留与 其所来自的抗体相同的结合特异性以及足够的亲和性，优选所述足够的亲和性至少等于其 所来自的抗体对靶标亲和性的1/100、更优选的方式为至少1/10。这种功能片段含有其所 来自的抗体序列的至少5个氨基酸，优选10、15、25、50或100个连续的氨基酸。
[0056] 术语"表位"是指被抗原结合蛋白（包括抗体）所结合的抗原区域。表位可被定义 为结构的或功能的。功能表位通常是结构表位的子集，其具有对相互作用的亲和性有直接 贡献的那些残基。表位也可以是构象的，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方式中，表位 可以包括决定簇，决定簇是化学活性的分子表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基， 以及在某些实施方式中，可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。
[0057] 在本申请中，所述表位位于人蛋白Axl的细胞外结构域中。
[0058] 根据本发明优选的实施方式，抗原结合蛋白、或其抗原结合片段特异性结合至位 于人蛋白Axl的细胞外结构域中的表位，优选具有序列SEQ ID NO. 31或32或其天然变体 序列。
[0059] "结合"等，意图表示抗原结合蛋白或其抗原结合片段与抗原形成生理条件下相对 稳定的复合物。确定两个分子是否结合的方法是本领域中是众所周知的，并包括例如平衡 透析、表面等离子体共振等。
[0060] 在这个意义上，"EC5(I"是指50%的有效浓度。更精确地，术语半数最大有效浓度 (EC 5tl)对应着一段特定暴露时间之后，诱导基线和最大值之间一半反应的药物、抗体或毒物 的浓度。其通常用作药物效力的量度。因此，分级剂量反应曲线的EC 5tl代表观察到其最大 作用的50%时的化合物浓度。量子剂量反应曲线的EC5tl表示暴露特定时间段之后，群体的 50%表现出反应的化合物浓度。浓度测量通常遵循S形曲线，在浓度相对小的变化过程中 增加迅速。这可以通过最佳拟合线的推导而数学上进行确定。
[0061] 作为优选的实施方式，本发明中确定的EC5tl表征抗体结合暴露在人肿瘤细胞上的 Axl E⑶的效力。使用FACS分析确定EC5tl参数。EC5tl参数反映获得对人肿瘤细胞上表达 的人Axl的50%最大结合时的抗体浓度。使用四参数回归曲线拟合程序（Prism软件），各 EC5tl值计算为剂量反应曲线的中点。该参数已被选定为生理/病理状况的代表。
[0062] 在本发明的实施方式中，抗原结合蛋白、或其抗原结合片段，以至少10-9Μ，优选 KT9和KT12M之间的EC5tl结合其表位。
[0063] 本发明的另一实施方式，是一种选择能够被细胞内内在化到哺乳动物细胞中，优 选人细胞中，优选活细胞中的抗原结合蛋白或其抗原结合片段的过程或方法，其包括步 骤：
[0064] -i)选择结合Axl，优选结合其ECD结构域或其表位的抗原结合蛋白；以及 [0065] _ii)从之前的步骤i)中选择这样的所述抗原结合蛋白，即所述抗原结合蛋白结 合哺乳动物细胞表面上表达的Axl蛋白之后被内在化至所述哺乳动物细胞中。
[0066] 在具体的实施方式中，所述哺乳动物细胞在其表面上天然表达Axl蛋白受体，或 者所述哺乳动物细胞是在其表面上表达重组Axl蛋白的哺乳动物细胞，优选人细胞。
[0067] 这样的方法或过程可以包括以下步骤：i)选择以至少KT9M的EC5tl结合Axl的抗 原结合蛋白，以及ii)从之前的步骤中选择结合Axl之后被内在化的抗原结合蛋白。可以由 本领域技术人员已知的用于评价内在化的任何方法来实现ii)的选择步骤。更具体地说， 可以通过FACS、免疫荧光、流式细胞术、western印迹、细胞毒性评价等实现测试。
[0068] 根据本发明的抗原结合蛋白的另一个特征是，它对肿瘤细胞的增殖不具有任何显 著活性。更具体地，如下面实施例所示，根据本发明的抗原结合蛋白对增殖SN12C模型不具 有任何显著的体外活性。
[0069] 在肿瘤学中，存在多种机制，通过所述机制mAb可以发挥治疗效果，但通常其活 性不足以产生持久的益处。因此，一些策略已被用来增强其活性，特别是通过将其与作 为化疗剂的药物组合。作为一种对组合规程的有效替代方法，免疫毒素成为一种用于治 疗癌症的新治疗选择（Beck A.等人 Discov. Med. (2010). 10, 329-339 ;Alley S.C.等人 J. Pharmacol. Exp. Ther. (2009). 330, 932-938)。抗体药物缀合物（ADC)代表一种这样的方 法，其中利用mAb特异性以及将细胞毒性剂靶向递送至肿瘤的能力可显著增强mAb和药物 的活性。理想情况下，mAb将特异性结合大量表达在肿瘤细胞上但在正常细胞上却表达有 限的抗原。
[0070] 本发明关注抗Axl结合蛋白，以及更具体地关注特异性抗Axl抗体，其呈现出Axl 结合之后被内在化的高度能力。作为免疫-药物-缀合物的组成之一，这样的抗原结合蛋 白是令人感兴趣的，所以它将连接的细胞毒素带到靶向的癌症细胞中。一旦被内在化，细胞 毒素引发癌症细胞死亡。
[0071] 免疫缀合物疗法成功的重要关键之处被认为是靶标抗原的特异性和抗原结合蛋 白复合物内在化至癌症细胞中。显然，相较于内在化的抗原，非内在化的抗原不能有效递送 细胞毒性剂。随着抗原的不同内在化的过程是可变的，其取决于受结合蛋白影响的多种参 数。细胞表面的RTK构成一个对于研宄这种过程有趣的抗原家族。
[0072] 生物分子中，细胞毒素带来细胞毒性活性，所用的抗原结合蛋白带来其对癌症细 胞的特异性，以及用于进入细胞内来正确定位细胞毒素的载体。
[0073] 因此，为了改善免疫缀合分子，载体结合蛋白必须表现出高的内在化至靶标癌症 细胞中的能力。结合蛋白介导的内在化的效率根据所靶向表位的不同而显著不同。选择强 效的内在化抗Axl结合蛋白，不仅需要研宄Axl下调的各种实验数据还需要研宄抗Axl结 合蛋白进入细胞之后的各种实验数据。
[0074] 在优选的实施方式中，可以优选通过免疫荧光（如在本申请中下文举例说明的） 或通过本领域技术人员已知的任何内在化机制专门的方法或过程，评价根据本发明的抗原 结合蛋白的内在化。
[0075] 在另一个优选实施方式中，由于根据本发明的Axl-抗原结合蛋白复合物，在本发 明的结合蛋白结合所述Axl的ECD之后被内在化，所以诱导了 Axl在细胞表面的量减少。可 以通过本领域技术人员已知的任何方法（western印迹、FACS、免疫荧光等）定量这种减少。
[0076] 在本发明的实施方式中，因此体现内在化的这种减少，优选可以通过FACS进行测 量，并表示为在未处理细胞上测量的平均荧光强度（MFI)与根据本发明抗原结合蛋白处理 过的细胞上测量的MFI之间的差或Δ。
[0077] 作为本发明的非限制性实例，基于未处理的细胞和用本发明抗原结合蛋白处理过 的细胞所获得的MFI确定这种Λ，如实施例9中所描述的，使用i)用本发明抗原结合蛋白、 以及ii)标记有Alexa488的第二抗体，孵育24小时后的人肾肿瘤SN12C细胞。该参数被 定义为用下面的公式计算：
[0078]
[0079] 由于MFI与细胞表面上表达的Axl成比例，MFI之间的这种差异反映出Axl的下 调。
[0080] 在更优选和有利的方面，本发明的抗原结合蛋白或其抗原结合片段由单克隆抗体 优选分离的Mab组成，其引发至少200、优选至少300的Λ (MFI24h未处理的细胞-MFI 24h处 理的细胞）。
[0081] 根据本发明的抗原结合蛋白、或其抗原结合片段诱导至少200的MFI降低。
[0082] 更详细地，可以按照下面的方法测量上述Λ，其必须被视为说明性和非限制性的 实例：
[0083] a)用本发明的抗原结合蛋白处理和孵育兴趣肿瘤细胞；
[0084] b)处理步骤a)处理的细胞以及平行地处理未用本发明的抗原结合蛋白处理的细 胞，
[0085] c)用能结合抗原结合蛋白的第二标记抗体测量处理和未处理的细胞的MFI (代表 存在于表面的Axl量），以及
[0086] d)将Λ计算为未处理的细胞所获得的MFI减去处理的细胞所获得的MFI的差。
[0087] 以最广泛的意义，术语"抗体"或"免疫球蛋白"可以互换使用，并且包括单克隆抗 体