马立克氏病病毒感染性重组克隆系统及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种病毒感染性重组克隆系统，具体涉及一种马立克氏病病毒感染性 重组克隆系统及其构建方法和应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 马立克氏病（MD)是由马立克氏病病毒（MDV)引起的一种鸡的传染性肿瘤病，以 淋巴组织增生和肿瘤形成为特征。马立克氏病是鸡的主要疾病之一，也是国内外50年代 以来最受重视的鸡病。MDV属于α-疱瘆病毒亚科马立克氏病样病毒属，是一种细胞结合 性疱瘆病毒，其基因组为线状双股DNA，约为180kb，组成模式为TRf UfIRf IRS-US-TRS。MDV 至少编码103个蛋白质，然而大多数蛋白仍未得到鉴定。MDV包括三种血清型，血清1型 病毒具有致瘤性，可进一步分为几个病理型，包括温和型MDV(mMDV)、强毒型MDV(vMDV)、 超强毒型MDV(vvMDV)及特超强毒型MDV(vv+MDV)病毒株。鸡的非致瘤病毒分尚株和火 鸡疱瘆病毒分离株分别称作血清2型和3型MDV (Biggs, P. M The history and biology of Mareki s disease virus. In:Hirai,K. (Ed. )，Marek' s Disease.Springer-Verla g, Berlin, Heidelberg, New York, 2001, pp. 1-24 ；Calnek, B. ff. , Witter, R. L. Mareki s disease.In:Calnek,B.ff. (Ed.),Diseases of Poultry.Iowa State University Press, Ames, 1997, pp. 369-413.)。
[0003] 重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌构建成一个载体，然后把外源基 因插入其中使之表达的活疫苗。该类疫苗诱导机体产生的免疫比较广泛，包括体液免疫和 细胞免疫，甚至粘膜免疫；更为重要的，活载体疫苗可以同时表达多种抗原，制成多价或多 联疫苗，起到一针防多病的效果，是当今和未来疫苗研发的主要方向之一。研宄表明，疱 瘆病毒基因组较大，可供外源基因插入或替换的复制非必需基因多，是一种理想的构建重 组活载体疫苗的病毒载体。疱瘆病毒活载体主要包括伪狂犬病毒（PRV)、I型牛疱瘆病毒 (BHV-I)和马立克氏病病毒（MDV)等。目前，已有大量疱瘆病毒活载体疫苗的研宄报道，如 郭万柱等以PRV闵A株为载体构建了 PRV的TK/gE/gl三基因缺失株并获得国家新兽药证 书。Tsukamoto K等（2002)构建了表达传染性法氏囊病病毒（IBDV) VP2基因的重组火鸡疱 瘆病毒，免疫SPF鸡后足以抵抗IBDV强毒的攻击（Tsukamoto K.，Saito S.，Saeki S.，et al. Complete, Long-Lasting protection against lethal infectious bursal disease virus challenge by a single vaccination with an avian herpesvirus vector expressing VP2 antigens. J Virol. 2002, 76 (11) : 5637-5645.)。作为痕疼病毒科的一 员，MDV同样是一种良好的活疫苗载体，研宄发现在MDV的US2区插入IBDV的VP2基因、 在USlO区插入新城疫病毒的F基因获得的重组MDV对MDV强毒的保护效果与对照MDV相 当（Tsukamoto K. , Kojima C. , Komori Y. , et al. Protection of chickens against very virulent infectious bursal Disease virus (IBDV) and Marek's disease virus (MDV) with a recombinant MDV expressing IBDV VP2. Virology 1999, 257:352-362 ；Sonoda K. , Sakaguchi M. , Okamura H.,et al. Development of an effective polyvalent vaccine against both Marek's and Newcastle diseases based on recombinant Marek's disease virus type I in commercial chickens with maternal antibodies.J Virol. 2000, 74(7) :3217-3226.) 〇
[0004] 目前构建MDV重组活载体疫苗主要使用的是同源重组法和细菌人工染色体（BAC) 法。其中同源重组法是将外源基因插入到带有同源臂的入门质粒中转染病毒感染细胞或与 病毒基因组共转染易感细胞，通过细胞中的同源重组过程获得重组病毒。该方法构建过程 复杂费时而且效率较低，需要加入筛选标记基因并进行重组病毒的纯化。细菌人工染色体 (BAC)法是将完整的MDV基因组插入到BAC中并在细菌中对其进行改造。BAC法是建立在 同源重组基础上的，同样具有构建过程复杂、周期长的缺点；而且BAC自身序列难以去除， 使得后期获得的重组病毒带有不必要的外源基因序列，存在安全隐患（Zelnik，V.Marek' s disease virus research in the post-sequencing era:new tools for the study of gene functions and virus-host interactions. Avian Pathol. 2003, 32:323-333.) 〇建立 一种快捷、高效、安全的MDV活载体疫苗构建平台在当前具有重要的理论意义和应用前景。 另外，MDV的研宄与其他疱瘆病毒相比相对滞后，对其基因组中外源基因插入位点的报道较 少。鉴定并筛选MDV基因组中的外源基因插入位点有助于提高外源基因的表达水平，进而 提高MDV活载体疫苗的免疫效力。
[0005] Fosmid粘粒是一种可以容纳30_45kb大小外源DNA的克隆载体，常用于基因文 库的构建（Vinayak，S.，Brooks, C. F.，Naumov, A.，et al. Genetic manipulation of the Toxoplasma gondii genome by fosmid recombineering. MBio. 2014, 5 (6) : e02021.) 〇本石开 宄将目前现地广泛使用的MDV弱毒疫苗814株基因组DNA分段插入Fosmid粘粒中，构建了 该疫苗株基因组的Fosmid文库，并在此基础上建立了 MDV多片段Fosmid拯救系统。进一 步，本研宄将增强型绿色荧光蛋白（eGFP)基因插入到MDV疫苗株基因组的UL41、UL45/46、 UL55/L0RF10、US2和USlO五个位点，拯救出5株表达eGFP的重组MDV疫苗株，从而在MDV 疫苗株基因组中鉴定出5个可供外源基因插入的复制非必需区。
【发明内容】
[0006] 作为一种疱瘆病毒，MDV较大的基因组使其便于外源基因的插入，因此研宄者们多 年来一直致力于MDV活载体疫苗的研宄。目前MDV重组病毒的构建大多采用同源重组法。 这种方法构建重组病毒比较费时耗力，后期需要对重组病毒进行克隆纯化并去除抗性标记 基因等，过程较为复杂。建立一种快捷高效的MDV重组病毒构建系统对于MDV活载体疫苗 的研宄十分必要。本发明在之前构建的MDV疫苗株多片段粘粒拯救系统的基础上，对重组 粘粒进行了改造，建立了 MDV疫苗株感染性重组克隆系统，并应用该系统拯救了表达eGFP 的重组MDV疫苗株病毒，对MDV基因组中的复制非必需区进行了研宄。
[0007] 本发明的目的在于提供一种马立克氏病病毒感染性重组克隆系统，该系统可以快 捷高效的将外源基因表达盒克隆入MDV基因组，进而实现MDV重组病毒的拯救。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009] 一种马立克氏病病毒感染性重组克隆系统，其特征在于，所述系统包括多个粘粒， 每个粘粒中克隆有马立克氏病病毒疫苗株基因片段，所述马立克氏病病毒疫苗株基因片段 含有相互重叠区域并可拼接覆盖完整马立克氏病病毒疫苗株基因组，其中至少一个所述粘 粒的复制非必需区中插入有外源基因。
[0010] 在本发明中，优选的，所述粘粒为pCCIFos。
[0011] 在本发明中，优选的，所述马立克氏病病毒为马立克氏病病毒弱毒疫苗814株。
[0012] 在本发明中，优选的，所述粘粒为5个粘粒，5个粘粒分别为p814-l、p814-2、 P814-3、p814-4、p814-5,其中克隆的马立克氏病病毒疫苗株基因片段的序列分别为马立 克氏病病毒 814 株的 1-47873 位、40028-79118 位、72447-113806 位、106337-139612 位和 129115-172541 位。
[0013] 在本发明中，优选的，所述复制非必需区位于p814-3中的UL41基因内，p814-3中 的UL45和UL46基因之间，p814-4中的UL55和L0RF10基因之间，p814-5中的USlO基因内 以及P814-5中的US2基因内。
[0014] 进一步的，本发明提供了构建所述的马立克氏病病毒感染性重组克隆系统的方 法，包括以下步骤：
[0015] (1)切断所述马立克氏病病毒的DNA，并将切断后的马立克氏病病毒的DNA片段连 接到粘粒上；
[0016] (2)选择多个粘粒组成所述马立克氏病病毒感染性重组克隆系统，其中每个粘粒 中克隆有马立克氏病病毒疫苗株基因片段，所述马立克氏病病毒疫苗株基因片段含有