丝状真菌基因组的提取方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及一种丝状真菌基因组提取方法，尤其涉及一种产黄青霉菌基因组的提 取方法。
【背景技术】
[0003] 工业微生物中，丝状真菌是一类十分重要的类群，尤其在抗生素、有机酸、酶制剂 三大生产领域，丝状真菌的生产性能极为突出，如产黄青霉是 青霉素的重要生产丝状真菌；黑曲霉是柠檬酸的重要工业发酵菌 种；里氏木霉（ZricAoofe/mareesei)是纤维素酶的重要工业发酵菌种。为进一步提高青 霉素、柠檬酸及纤维素酶的产量，从分子水平上对工业菌株进行改造有着广泛的应用前景。 丝状真菌基因组DNA的提取是进行分子生物学研宄的基础，但丝状真菌由于其细胞壁结构 坚固，成分复杂，破壁困难，因此丝状真菌基因组提取方法与细菌相比要复杂得多。现行有 效的丝状真菌基因组提取方法主要有：酶解法，研磨法、冻融法和微波法、CTAB法、SDS法、 试剂盒法、尿素提取法等。这些方法都可以提出较高质量的基因组DNA，能够满足后续的如 PCR反应的基因操作需求，但对于成千上万个丝状真菌转化子的分子鉴定及筛选，应用这些 常规方法提取基因组，其繁杂的提取过程是限制实验进展的一个重要环节；另外，常规的提 取方法中均采用多种试剂对细胞进行破壁处理、酚/氯仿抽提去除蛋白质、乙醇或异丙醇 沉淀等多步骤提取DNA，提取过程冗长，且有机试剂具腐蚀性和毒性，对操作者身体健康不 利。
【发明内容】
[0004] 为解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种简易、安全，不需使用有毒试剂 的丝状真菌基因组的提取方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明的一种丝状真菌基因组的提取方法，其特征在于，该方法 包括以下步骤： a、 获取丝状真菌菌丝； b、 加入酶液：向丝状真菌菌丝加入蜗牛酶和纤维素酶的混合酶液，得到丝状真菌菌丝 液； c、 超声处理：将步骤b获得的丝状真菌菌丝液于40~70W超声5~15min ; d、 酶解：将步骤c处理后的丝状真菌菌丝液在25~40°C酶解10~15h，得到丝状真菌菌丝 酶解液； e、 将丝状真菌菌丝酶解液静置，待丝状真菌菌丝酶解液分层后，获得供PCR鉴定用含 有丝状真菌基因组的上清液； 在步骤a与步骤b之间或步骤d与步骤e之间，设有对丝状真菌菌丝或丝状真菌菌丝 酶解液进行高温加热处理步骤，所述高温加热处理步骤中的加热温度为75~100°C，加热时 间为 5~15min。
[0006] 对丝状真菌细胞仅进行酶解破壁处理，会因破壁后存在的大量杂质影响，造成DNA 不稳定，使后续PCR过程扩增得不到基因条带。本发明采取酶解法，结合超声处理与高温 加热处理的方式：向丝状真菌菌丝加入蜗牛酶和纤维素酶的混合酶液，然后通过超声处理 将丝状真菌菌丝分散到混合酶液中，破坏菌丝的致密状态，使大部分菌丝能够接触到混合 酶液而被酶解，同时，超声作用有助于后续酶解反应的进行；之后通过高温处理对细胞裂解 后释放的DNase等降解DNA的活性物质及混合酶液中存在的影响PCR反应的活性物质进行 灭活，从而使丝状真菌菌丝酶解液的上清液可以直接进行PCR扩增得到丝状真菌18S rDNA 基因条带。制备方法中高温加热处理也可在丝状真菌菌丝液加入混合酶液前进行，同样能 够对细胞内存在的降解DNA及影响PCR反应的物质起到灭活的作用。本发明的提取方法操 作流程简单，且不需使用试剂对DNA进行提纯，避免了毒性试剂对实验人员的伤害，简化了 提取过程，使提取方法更安全，稳定。
[0007] 作为对上述方式的限定，所述高温加热处理步骤中的加热温度为95~98°C，加热时 间为 10~15min。
[0008] 作为对上述方式的限定，所述步骤e中丝状真菌菌丝酶解液静置前，用双蒸水稀 释，混匀。
[0009] 所获样品量大时通过稀释有利于PCR反应。
[0010] 作为对上述方式的限定，所述步骤b每0. 05~0.1 mg丝状真菌菌丝加入混合酶液 lmL，所述混合酶液中蜗牛酶浓度4~8mg/mL，纤维素酶浓度2000~6000U/mL。
[0011] 酶浓度过低，不足以破坏细胞壁，致使DNA不能有效释放；酶浓度过高，细胞壁裂 解完全，细胞膜受到破坏，致使DNA释放出来而被酶解液中物质降解，从而使PCR反应结果 受到影响。
[0012] 作为对上述方式的限定，所述混合酶液中蜗牛酶浓度6~8mg/mL，纤维素酶浓度 2000~4000U/mL〇
[0013] 作为对上述方式的限定，所述步骤b混合酶液的配制溶剂为渗透剂，所述渗透剂 为0. 7mol/L的NaCl溶液、lmol/L山梨醇溶液或裂解液中的一种，所述裂解液为50mM磷酸 缓冲液，〇· 7mol/L KC1，ρΗ5· 8 的溶液。
[0014] 混合酶液由蜗牛酶和纤维素酶分别溶解在渗透剂中制得，渗透剂的作用是稳定产 黄青霉菌细胞形成的原生质体，降低原生质体受杂质的影响。
[0015] 作为对上述方式的限定，所述步骤c的超声功率为50W。
[0016] 作为对上述方式的限定，所述步骤d的酶解温度为28°C，酶解时间为14h。
[0017] 作为对上述方式的限定，所述丝状真菌为产黄青霉菌、黑曲霉菌、里氏木霉菌或桔 青霉菌中的一种。
[0018] 综上所述，采用本发明的技术方案，获得的丝状真菌菌丝酶解液的上清液不需通 过试剂提取处理可直接进行PCR反应，得到18S rDNA基因条带。本发明的丝状真菌基因组 提取方法，针对丝状真菌细胞壁的特性，将酶解法、超声处理和高温加热处理有序有效的结 合，使操作过程简单、安全、稳定，避免了有毒提取试剂的使用，减少对实验人员的伤害。
【附图说明】
[0019] 下面结合附图及【具体实施方式】对本发明作更进一步详细说明： 图1为本发明实施例1. 1的PCR鉴定结果； 图2为本发明实施例1. 2的PCR鉴定结果； 图3为本发明实施例2. 1的PCR鉴定结果； 图4为本发明实施例2. 2的PCR鉴定结果； 图5为本发明实施例2. 3. 1的PCR鉴定结果； 图6为本发明实施例2. 3. 2的PCR鉴定结果； 图7为本发明实施例2. 3. 3的PCR鉴定结果。
【具体实施方式】
[0020] 实施例一 本实施例涉及丝状真菌基因组的提取方法。
[0021] 实施例1. 1 本实施例涉及一种丝状真菌基因组的提取方法。
[0022] 实施例 I. I. 1 本实施例涉及一种产黄青霉基因组的提取方法，包括以下提取步骤： a、 获取产黄青霉菌丝：将产黄青霉菌的米孢子接种于固体培养基培养，挑取克隆获得 产黄青霉菌丝；或接种于含有玉米浆61g/L、蔗糖20g/L、CaC0 35g/L的产黄青霉液体生长培 养基，26°C震荡培养48h，1000 Orpm 2min离心收集，获得产黄青霉菌丝； b、 加入酶液：向步骤a的产黄青霉菌丝中加入含蜗牛酶浓度lOmg/mL的蜗牛酶液 60 μ L、含纤维素酶浓度10000U/mL的纤维素酶液40 μ L，共计混合酶液100 μ L，得到产黄青 霉菌丝液；混合酶液由商业购得的蜗牛酶和纤维素酶分别溶于渗透剂制得，蜗牛酶为混合 酶，以质量计浓度，纤维素酶为单一酶，以酶活计浓度，渗透剂使用〇. 7mol/L的NaCl溶液； c、 超声处理：将步骤b获得的产黄青霉菌丝液进行超声处理，超声强度50W，超声时间 15min ； d、 酶解：将步骤c处理后的产黄青霉菌丝液在28°C酶解14h，得到产黄青霉菌丝酶解 液；对产黄青霉菌丝酶解液进行高温加热处理，在95°C加热IOmin ; e、 将产黄青霉菌丝酶解液加入50~1(Κ)μL双蒸水（CldH2O)稀释，混匀，静置直至分层，获 得供PCR鉴定用含有产黄青霉菌基因组的上清液。
[0023] 实施例 I. 1. 2 本实施例涉及一种黑曲霉基因组的提取方法，包括以下提取步骤： a、 获取黑曲霉菌丝：将黑曲霉接种于察氏培养基(硝酸钠3g/L，磷酸氢二钾lg/L，硫酸 镁（MgS04*7H20) 0· 5g/L，氯化钾 0· 5g/L，硫酸亚铁 0· 01g/L，蔗糖 30g/L，琼脂 20g/L)培 养，26°C培养6d，获得黑曲霉菌丝； b、 加入酶液：向步骤a的黑曲霉菌丝中加入含蜗牛酶浓度lOmg/mL的蜗牛酶液70 μ L、 含纤维素酶浓度l〇〇〇〇U/mL的纤维素酶液30 μ L，共计混合酶液100 μ L，得到黑曲霉菌丝 液；混合酶液由商业购得的蜗牛酶和纤维素酶分别溶于渗透剂制得，蜗牛酶为混合酶，以质 量计浓度，纤维素酶为单一酶，以酶活计浓度，渗透剂使用〇. 7mol/L的NaCl溶液； C、超声处理：将步骤b获得的黑曲霉菌丝液进行超声处理，超声强度50W，超声时间 15min ； d、 酶解：将步骤c处理后的黑曲霉菌丝液在28°C酶解1