一种贝类总病毒核酸的制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明总病毒核酸的制备方法，尤其是涉及一种贝类总病毒核酸的制备方法。
【背景技术】
[0002] 贝类等软体动物是动物界的第二大门，物种非常丰富，分布非常广泛。因此，贝类 生物是生物多样性资源研宄的一个重要宝库。贝类的多样性又进一步决定了其体内病毒或 共生微生物的多样性。对贝类体内病毒或者微生物进行深入的研宄对水产品安全、水产养 殖健康发展、水生生物资源利用、医药研发等均具有重要的意义。
[0003] 然而，目前已知的具有完整基因组序列的贝类病毒很少。NCBI数据库中可查到的 只有牡蛎的OsHV、扇贝的AVNV、鲍鱼的AbHV和AbSV病毒。由于现有研宄技术的局限，现有 研宄都是通过传统的纯化方法先将特定病毒从发病样品（即病毒含量高的样品）中纯化出 来，然后再采用文库构建或PCR扩增等方法获得其全序列。这样的方法每次只能研宄一种 病毒，且必须从病毒含量高的感染材料中获得。健康贝类体内的病毒含量很低，根本无法获 取足够量的病毒，因此现有的方法无法对健康贝类体内存在的种类繁多但含量较低的病毒 进行同时研宄，这不仅严重制约了贝类病毒学的发展，也制约了水产养殖行业对贝类疾病 的管控。故，贝类病毒研宄亟需找到一种高效的能够同时鉴定贝类体内全部主要病毒的研 宄方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种贝类总病毒核酸的制备方法。该方法操作简单，获得 贝类总病毒核酸纯度高，且核酸完整，核酸浓度满足高通量测序的要求。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种贝类总病毒核酸的制备方法，包括 以下步骤：
[0006] (1)磨粉：在液氮环境下，将贝类组织样品磨成粉；
[0007] (2)匀浆：贝类组织样品粉末中加入PBS缓冲液，然后匀浆成浆料；
[0008] (3)获得总病毒粗提物：浆料经离心处理，所得的上清液经滤膜过滤后离心处理， 弃上清液，所得的沉淀即为总病毒粗提物；
[0009] (4)提取核酸：所述总病毒粗提物加入核酸酶溶液，制成悬浮液，于37°C摇床处理 25-40min，而后提取总病毒核酸；
[0010] (5)核酸扩增：对所述总病毒核酸进行扩增，以提高核酸浓度，有利于高通量测 序。
[0011] 本发明所述步骤（1)中，贝类组织样品包括健康贝类的腹足、内脏团、外套膜等在 内的全部组织器官。
[0012] 本发明所述步骤（2)中，PBS缓冲液与贝类组织样品之间的体积质量比为 10-12 : 1。所述 PBS 缓冲液含有以下组分：NaCl 135-140mmol/L，KCl 2.5-3. Ommol/L， Na2HP048-12mmol/L，KH2PO41-2. 5mmol/L, ρΗ7· 5〇
[0013] 本发明所述步骤（3)中，过滤前的离心处理至少进行两次，离心条件为：4°C， 10000_12000rpm离心25_35min。所述滤膜采用Millex-HV 0.45um滤膜。所述过滤后的离 心处理的条件为：10°C，35000-45000g离心1-1. 5h。
[0014] 本发明所述步骤⑷中，核酸酶溶液含有以下组分：100U DNase I，IOOug RNase A, 10-12mM Tris-HCl, 2. 0-3. OmM MgCl2,0. 5-lmM CaCl2, pH7. 5〇
[0015] 所述步骤（4)中，采用HP Viral DNA/RNA Kit进行总病毒核酸提取。
[0016] 所述步骤（5)中，米用 i I lustra GenomiPhi HY DNA Amplification Kit 进行总 病毒核酸扩增。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下显著的效果：
[0018] 本发明首先提取贝类组织中的总病毒，并进行纯化，尽量排除宿主核酸和组织碎 片的干扰，然后从纯化的总病毒样品提取病毒核酸，再利用扩增技术进一步制备出足够多 的病毒核酸，使核酸浓度彡20ng/uL，总量彡3ug，以便满足下游高通量测序的要求。因此， 本发明可以采用健康贝类为样品获取贝类总病毒核酸，利用高通量测序技术对贝类体内的 数十种病毒进行一次性的鉴定和定量，从根本上突破了传统方法只能利用发病材料研宄一 种病毒的局限。
【附图说明】
[0019] 图1是琼脂糖凝胶电泳检测总病毒核酸完整性的电泳图。
[0020] 上样顺序：从左至右依次为实施例1-5，λ-Hind III digest DNA Marker
【具体实施方式】
[0021] 实施例1-5的核酸制备方法如下：
[0022] (1)磨粉：在液氮环境下，将7g贝类组织样品磨成粉。贝类组织样品包括健康贝 类的腹足、内脏团、外套膜等在内的全部组织器官。
[0023] (2)匀浆：贝类组织样品粉末中加入70ml PBS缓冲液，然后充分匀衆，制成浆料。 PBS 缓冲液为：NaCl 137mmol/L，KCl 2. 7mmol/L，Na2HP0410mmol/L，KH2P042mmol/L，ρΗ7· 5〇
[0024] (3)获得总病毒粗提物：衆料4°C，1000 Orpm离心两次，每次离心30min，取上清液。 上清液经Millex-HV 0. 45um滤膜过滤，滤液放入离心管中，10°C，4000()g离心lh，弃上清 液，所得的沉淀即为总病毒粗提物。
[0025] (4)提取核酸：总病毒粗提物加入核酸酶溶液，充分悬浮，制成悬浮液，于37°C摇 床处理30min，而后使用HP Viral DNA/RNA Kit(0mega Bio-Tek公司）提取总病毒核酸。 核酸酶溶液为 100U DNase I，IOOug RNase A，IOmM Tris-HCl，2.5mM MgCl2,0.5mM CaCl2， ρΗ7· 5〇
[0026] 提取总病毒核酸：
[0027] a)向病毒悬浮液中加入0· 5mL Buffer MPG，颠倒30-50次；
[0028] b)室温放置lh，1000 Og离心15min，弃上清；
[0029] c)加 2OOuL 水、25uL OB Protease，充分悬浮沉淀；
[0030] d)加 200uL Buffer BL，混匀，55°C 处理 IOmin ;
[0031] e)加 250uL乙酉享，混勾，室温放置5min ;
[0032] f)将溶液加入纯化柱中（试剂盒中提供），柱子套在收集管上，8000g离心lmin， 弃滤液并换新收集管；
[0033] g)加 500uL Buffer VHB于柱上，8000g离心lmin，弃滤液并换收集管；
[0034] h)加 500uL RWB Wash Buffer，8000g 离心 lmin，弃滤液，不换收集管；
[0035] i)重复步骤h) -次；
[0036] j)换一新的1.5mL离心管，在柱子中央加 40uL水，室温放置5min，8000g离心 lmin，滤液即为核酸溶液。
[0037] (5)核酸扩增：使用 illustra GenomiPhi HY DNA Amplification Kit (GE Healthcare公司）对总病毒核酸进行扩增，以提高核酸浓度，有利于高通量测序。
[0038] a)取2. 5uL病毒核酸溶液，加入22.