鲍肌肉萎缩症病毒的氯化铯密度梯度离心提取方法
【技术领域】
[0001]本发明提供一种鲍病毒的提取方法，尤其是涉及一种鲍肌肉萎缩症病毒的氯化铯密度梯度离心提取方法。
【背景技术】
[0002]鲍，俗称鲍鱼，属软体动物腹足纲，是贝类的一种，在海洋生态系统中占有重要地位。鲍鱼又是中华民族的传统美食，是我国重要的海水养殖品种，具有很高的营养价值。病毒或噬菌体广泛存在于鲍等各类生物体内，它们的存在能够调节宿主肠道种群，平衡宿主及其体内共生微生物的代谢关系，控制病害的发生等。
[0003]近年来，在中国的养殖鲍鱼体内发现了一种神秘的鲍肌肉萎缩症病毒(AbSV)。它的形态和大小未知，已测序的基因组与目前已知的所有病毒基因组相似性都很低，是一种全新的病毒。该病毒在各类鲍养殖品种中广泛存在，但在其它贝类生物中却未被发现。尤其重要的是该病毒可能与击垮我国杂色鲍养殖业的鲍低温病毒病爆发密切相关。
[0004]目前，制约该病毒研宄的技术瓶颈之一就是提取方法。现有提取方法采用蔗糖作为超速离心的分离介质，但它无法将病毒和血蓝蛋白等宿主蛋白有效分离(甚至有研宄误把血蓝蛋白当成病毒粒子)，提取物成分十分复杂，难以进行下游应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种鲍肌肉萎缩症病毒的氯化铯密度梯度离心提取方法。该方法能有效分离鲍病毒及宿主血蓝蛋白，并能确定病毒层，有利于获得高纯度的病毒样品O
[0006]本发明的目的通过以下技术方案来实现:一种鲍肌肉萎缩症病毒的氯化铯密度梯度离心提取方法，包括以下步骤:
(1)在液氮环境下，将病毒感染的鲍组织样品磨成粉；
(2)鲍组织样品粉末中加入PBS缓冲液，然后匀浆，所得匀浆液置于液氮和水浴中反复冻融，以充分裂解细胞；
(3)对经冻融处理后的匀浆液进行离心处理，所得的上清液经滤膜过滤后，再离心处理，所得的沉淀即为鲍肌肉萎缩症病毒粗提物；
(4)所述沉淀中加入含牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液进行重悬，得到重悬液；
(5)将重悬液加到氯化铯(CsCl)密度梯度液的液面上，离心，回收病毒液；
(6)对病毒液进行离心处理，弃上清，沉淀即为鲍肌肉萎缩症病毒。
[0007]本发明所述步骤(I)中，鲍组织样品为除性腺外的各组织。
[0008]本发明所述步骤⑵中，PBS缓冲液含有以下组分:NaCl 135-140 mM，KCl
2.5-3.0 mM，K2HPO4 8-12 mM，KH2PO4 1-2.5 mM，ρΗ7.5。所述鲍组织样品与 PBS 缓冲液之间的质量体积比为1: 9-12 (g/ml)。
[0009]所述步骤(2)中匀浆液置于液氮和水浴中反复冻融的次数为2-3次。水浴温度为20?40 °C ο
[0010]所述步骤(3)中离心处理是采用高速冷冻离心机在4 °C下，以转速11000-14000rpm对经冻融处理后的匀浆液离心15_40min。
[0011]所述步骤(3)中滤膜的孔径为0.22-0.45um。
[0012]所述步骤(3)中对滤膜过滤所得的滤液的离心处理是使用超速离心机在10°C下，以转速 20000-40000 rpm 离心 0.5-2h。
[0013]所述步骤(4)中，所述含牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中牛血清蛋白的浓度为0.5-3%(W/V);而用于重悬的含牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液的量为0.5-2mL。
[0014]所述步骤(5)中，CsCl密度梯度液采用含0.5-3%的BSA的PBS缓冲液配置，离心管中从下至上溶液层的氯化铯质量百分比浓度依次为40-60%、30-40%、20-30%、10_20%。
[0015]所述步骤(5)中的离心处理使用超速离心机在10°C下，以转速15000-40000 rpm离心 20-30ho
[0016]所述步骤(5)中，氯化铯密度梯度离心后，收集各层溶液并采用qPCR检测各层溶液中的病毒拷贝数，以确定病毒层，合并病毒层溶液获得病毒液。
[0017]所述步骤￠)中的离心处理使用超速离心机在10°C下，以转速15000-40000 rpm离心l-2ho
[0018]与现有技术相比，本发明具有如下显著的效果:
(I)本发明中采用氯化铯作为超离介质，能获得比蔗糖为超离介质时更好的分离效果O
[0019](2)重悬细胞时，添加的BSA能够保护病毒粒子，使其免于被重金属铯离子解聚，以利于延长超速离心时间。
[0020](3)极大延长了超速离心的时间，使得病毒能够与宿主血蓝蛋白和铁蛋白充分分离。
[0021](4)采用qPCR方法确定病毒层的位置，从而解决了病毒含量低病毒层无法肉眼辨别的问题。
【附图说明】
[0022]图1是各氯化铯溶液层qPCR检测结果；
其中，实线为蛋白含量，虚线为病毒拷贝数，5-7层为病毒层，1-2层为宿主血蓝蛋白层，13层为宿主铁蛋白层。可见病毒和宿主血蓝蛋白、铁蛋白有效分离。
[0023]图2是本发明提取的病毒的电镜图；
图中显示，提取物(A)中已彻底去除了血蓝蛋白干扰，可见到处都是直径20-30nm左右的球型病毒粒子，标尺为lOOnm。
[0024]图3是现有技术提取的病毒的电镜图；
提取物(B)中可见到处都是血蓝蛋白，根本无法看到病毒粒子。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
(I)取1g病毒感染杂色鲍组织(除性腺外的各组织)，在液氮环境下研磨成粉末。
[0026](2)鲍组织样品粉末中加入10mL PBS缓冲液，匀楽，得匀浆液。其中，SB缓冲液的 pH 为 7.5，每 10ml 中含有 135 mM NaCl，2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4,8 mM Κ2ΗΡ04。所得匀浆液置于液氮和25°C水浴中反复冻融3次，以充分裂解细胞。
[0027](3)对经冻融处理后的匀浆液使用普通高速冷冻离心机，在4°C下，以转速12000rpm离心30min，收集上清液，重复离心处理3次，然后用0.22um滤膜过滤上清液，使用超速离心机对过滤所得的溶液在10°C下，以转速40000rpm离心lh，弃上清，所得的沉淀即为鲍肌肉萎缩症病毒粗提物。
[0028](4)在沉淀中加入含1.5%牛血清白蛋白(BSA)的Iml PBS缓冲液进行重悬，得到重悬液。
[0029](5)采用含1.5%牛血清白蛋白(BSA)的Iml PBS缓冲液配置CsCl密度梯度液，离心管中从下至上溶液层的氯化铯质量百分比浓度依次为45%、35%、25%、15%。将重悬液加到配置好的CsCl密度梯度液的最上层的液面上，使用超速离心机在10°C下，以转速40000rpm离心24h。在离心管底部钻一个小孔，依次收集各液层。取各液层Iul作为模板进行qPCR检测，确定各层溶液中病毒拷贝数并根据qPCR检测结果确定病毒组分位置，病毒含量高的液层即为病毒组分，最上层蓝色组分为宿主血蓝蛋白层，最下层红色组分为宿主铁蛋白层。如图1所示，本实施例中，5-7层为病毒层，1-2层为宿主血蓝蛋白层，13层为宿主铁蛋白层。可见病毒和宿主血蓝蛋白、铁蛋白得到有效分离。qPCR检测条件:20uL PCR反应体系中包括 IuL 的模板(层析收集液)，1uL iQ SYBR Green Supermix (B1-Rad, Hercules, CA,USA)，500 nmol/L AbSV3F3 上游引物(TGCCTAAAATTCACACAAACT)，500 nmol/L AbSV3B3 下游引物(ACAGACAAAATGTTTTTCATCG)。在Eppendorf Mastercycler ep realplex (Eppendorf,Hamburg, Germany)焚光定量PCR仪上进行PCR反应，程序为94。C I min, 30个循环:94。C 30 S，60。C 30 s, 72。C 20 s,最后 72。C 延伸 lOmin。
[0030]合并病毒层溶液，使用超速离心机在10°C下，以转速40000rpm离心lh，弃上清，沉淀即为鲍肌肉萎缩症病毒提取物。由电镜观察结果(图2)可见，提取物(A)中已彻底去除了血蓝蛋白干扰，可见到处都是直径20-30nm左右的球型病毒粒子。而图3中的提取物(B)中可见到处都是血蓝蛋白，根本无法看到病毒粒子，说明所得的病毒提取物纯度较高，无血蓝蛋白的干扰。
[0031]实施例2
(I)取9g病毒感染杂色鲍组织(除性腺外的各组织)，在液氮环境下研磨成粉末。
[0032](2)鲍组织样品粉末中加入10mL PBS缓冲液，匀楽，得匀浆液。其中，SB缓冲液的 pH 为 7.5，每 10ml 中含有 140 mM NaCl，2.5mM KCl, 2.5 mM KH2PO4,12 mM Κ2ΗΡ04。所得匀浆液置于液氮和40°C水浴中反复冻融3次，以充分裂解细胞。
[0033](3)对经冻融处理后的匀浆液使用普通高速冷冻离心机，在4°C下，以转速IlOOOrpm离心40min，收集上清液。重复离心处理3次，然后用0.22um滤膜过滤上清液，使用超速离心机对过滤所得的溶液在10°c下，以转速30000rpm离心1.5h，弃上清，所得的沉淀即为鲍肌肉萎缩症病毒粗提物