人胃癌二甲双胍耐药细胞株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤生物学领域，尤其是人胃癌二甲双胍耐药细胞株及其应用。
【背景技术】
[0002] 胃癌（Gastric cancer)是我国的常见肿瘤。据2012年世界卫生组织统计，胃癌 新发病例70 %位于发展中国家，主要位于我国。其发病率和死亡率居所有恶性肿瘤第三位。 我国胃癌发病具有明显的地域性，西北与东部沿海地区的发病率明显高于南方地区。胃癌 好发于50岁以上，男女发病率之比为2:1。胃癌的预后与病理分期、组织类型、分化程度、 ?!分期及治疗方式密切相关。近年来胃癌手术、化疗、放疗手段的不断完善，但患者的5 年生存率仍未见明显提高，多数患者最终死于肿瘤复发、转移及其相关的并发症。内科治疗 作为重要的辅助治疗手段，对于延长患者生存、改善患者生活质量，起到了重要而积极的作 用。随着对胃癌生物学行为的了解，内科治疗手段也得以不断丰富和完善。如分子靶向治 疗药物赫赛汀与化疗药物联合，提高了晚期进展期胃癌患者的生存等等。近年来多项回顾 性临床研宄表明，抗糖尿病药二甲双胍可降低恶性肿瘤（包括胃癌）的发病率和死亡率，同 时与化疗药物联合可以提高乳腺癌患者新辅助化疗的病理完全缓解率，这些研宄为二甲双 胍在肿瘤中的运用奠定了一定的理论基础。同时，关于其抗肿瘤作用的机制研宄也不断深 入。而对于二甲双胍耐药机制研宄，目前少见有文献报道。二甲双胍耐药人胃癌细胞株的 建立，可成为研宄胃癌的耐药机制、耐药性逆转、开发和评价新的抗癌方法等的重要工具。
【发明内容】
[0003] 基于此，有必要提供一种人胃癌二甲双胍耐药细胞株及其应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
[0005] 一种人胃癌二甲双胍耐药细胞株BGC823/二甲双胍，保藏于中国典型培养物保藏 中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC C2014163,保藏日期为2014年12月26 号。
[0006] 本发明的细胞株采用反复大剂量冲击联合逐步递增药物浓度法来建立源于亲代 细胞BGC823的人胃癌二甲双胍耐药细胞株。该方法包括以下步骤：
[0007] (1)细胞株人胃癌BGC823细胞系由中科院细胞室提供，该细胞加入含10%小牛 血清的DMEM培养液中，置37 °C、5 % CO2、饱和湿度的培养箱中培养，0. 25 %的胰蛋白消化传 代；
[0008] (2)取对数期生长期860823细胞或当860823细胞培养至细胞密度达到80%时， 换新鲜DMEM培养液，加入二甲双胍，形成含二甲双胍的DMEM培养液，其中二甲双胍浓度为 25mmol/L，置37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养，24小时后弃去含二甲双胍的 DMEM培养液，并用PBS液清洗2遍，加入新鲜DMEM培养液继续培养，使剩余细胞恢复到对数 生长期或细胞密度达到80 %并传代；
[0009] (3)重复步骤（2) 3至5次，其中使用含二甲双胍的DMEM培养液时，二甲双胍的浓 度为25mmol/L ;若3至5次重复培养仍无法达到稳定生长、传代，可增加重复培养的次数， 直到人胃癌BGC823细胞能在此浓度（二甲双胍浓度25mmol/L)的含二甲双胍的DMEM培养 液稳定生长、传代；
[0010] (4)取上一步获得的对数期生长期细胞或当细胞培养至细胞密度达到80%时，换 新鲜DMEM培养液，加入二甲双胍，形成含二甲双胍的DMEM培养液，其中二甲双胍浓度为 5 0 mmo I / L，置3 7 °C、5 % C O2、饱和湿度的培养箱中继续培养，2 4小时后弃去含二甲双胍的 DMEM培养液，并用PBS液清洗2遍，加入新鲜DMEM培养液继续培养，使剩余细胞恢复到对数 生长期或细胞密度达到80 %并传代；
[0011] (5)重复步骤（4)3至5次，其中使用含二甲双胍的DMEM培养液时，二甲双胍的浓 度为50mmol/L ;若3至5次重复培养仍无法达到稳定生长、传代，可增加重复培养的次数， 直到人胃癌BGC823细胞能在此浓度（二甲双胍浓度50mmol/L)的含二甲双胍的DMEM培养 液稳定生长、传代；
[0012] (6)取上一步获得的对数期生长期细胞或当细胞培养至细胞密度达到80%时， 换新鲜DMEM培养液，加入二甲双胍，形成含二甲双胍的DMEM培养液，其中二甲双胍浓度为 75mmol/L，置37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养，24小时后弃去含二甲双胍的 DMEM培养液，并用PBS液清洗2遍，加入新鲜DMEM培养液继续培养，使剩余细胞恢复到对数 生长期或细胞密度达到80 %并传代；
[0013] (7)重复步骤（6) 3至5次，其中使用含二甲双胍的DMEM培养液时，二甲双胍的浓 度为75mmol/L ;若3至5次重复培养仍无法达到稳定生长、传代，可增加重复培养的次数， 直到人胃癌BGC823细胞能在此浓度（二甲双胍浓度75mmol/L)的含二甲双胍的DMEM培养 液稳定生长、传代；
[0014] (8)取上一步获得的对数期生长期细胞或当细胞培养至细胞密度达到80%时，换 新鲜DMEM培养液，加入二甲双胍，形成含二甲双胍的DMEM培养液，其中二甲双胍浓度为 100mm 〇l/L，置37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养，24小时后弃去含二甲双胍的 DMEM培养液，并用PBS液清洗2遍，加入新鲜DMEM培养液继续培养，使剩余细胞恢复到对数 生长期或细胞密度达到80 %并传代；
[0015] (9)重复步骤（8) 3至5次，其中使用含二甲双胍的DMEM培养液时，二甲双胍的浓 度为lOOmmol/L ;若3至5次重复培养仍无法达到稳定生长、传代，可增加重复培养的次数， 直到人胃癌BGC823细胞能在此浓度（二甲双胍浓度lOOmmol/L)的含二甲双胍的DMEM培 养液稳定生长、传代；
[0016] (10)取上一步获得的对数期生长期细胞或当细胞培养至细胞密度达到80%时， 换新鲜DMEM培养液，加入二甲双胍，形成含二甲双胍的DMEM培养液，其中二甲双胍浓度为 125mmol/L，置37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养，24小时后弃去含二甲双胍的 DMEM培养液，并用PBS液清洗2遍，加入新鲜DMEM培养液继续培养，使剩余细胞恢复到对数 生长期或细胞密度达到80 %并传代；
[0017] (11)重复步骤（10)3至5次，其中使用含二甲双胍的DMEM培养液时，二甲双胍的 浓度为125mmol/L ;若3至5次重复培养仍无法达到稳定生长、传代，可增加重复培养的次 数，直到人胃癌BGC823细胞能在此浓度（二甲双胍浓度125mmol/L)的含二甲双胍的DMEM 培养液稳定生长、传代；
[0018] (12)取上一步获得的细胞在新鲜DMEM培养液中稳定生长、传代培养1个月后， 取对数期生长期细胞或当细胞培养至细胞密度达到80 %时，接入含二甲双胍的DMEM培养 液，其中二甲双胍浓度为50mmol/L，直到人胃癌BGC823细胞能在此浓度（二甲双胍浓度 50mmol/L)的含二甲双胍的DMEM培养液稳定生长、传代；即获得人胃癌二甲双胍耐药细胞 株。
[0019] 对本方法建立的人胃癌二甲双胍耐药细胞株进行形态学观察及生物学特性鉴定， 结果显示人胃癌二甲双胍耐药细胞株细胞形态发生改变，细胞体积变大，生长速度减慢，S 期细胞明显增多，耐药指数为5. 13。
[0020] 所述的人胃癌二甲双胍耐药细胞株可以用于在构建体内外肿瘤耐药模型，进一步 的可以用于构建人胃癌二甲双胍耐药机制的探讨及其相关信号通路的研宄的细胞模型，进 一步的可以用于筛选新的抗肿瘤药物。
[0021] 本发明可以用于研宄人胃癌二甲双胍耐药细胞形态学及生物学特点、研宄肿瘤耐 药机制、分析抗肿瘤药物敏感性及筛选和评估抗肿瘤药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研宄更 有效的肿瘤治疗方法等，具有较高的科研和生产应用价值，预期能产生良好的科研、经济和 社会效益。
【附图说明】
[0022] 图1为人胃癌BGC823活细胞在倒置相差显微镜下拍摄的照片；
[0023] 图2为人胃癌二甲双胍耐药活细胞在倒置相差显微镜下拍摄的照片；
[0024] 图3为人胃癌BGC823细胞周期分析图；
[0025] 图4为人胃癌二甲双胍耐药细胞株细胞周期分析图。
【具体实施方式】
[0026] 为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式 详予说明。
[0027] 本发明中涉及的现有试验方法、测试方法及溶液配制方法可以参考《细胞实验指 南》，标准书号：7-03-007598-6/Q. 891原著：[美]D. L.斯佩克特R. D.戈德曼&L.A.莱因万 德。
[0028] 所述的DMEM培养液优选的为高糖型，按照惯常的配置方法配置，或者通过购买市 售商品获得。
[0029] 实施例1 :人胃癌二甲双胍耐药细胞株的建立
[0030] 步骤如下：（1)细胞株人胃癌BGC823细胞系由中科院细胞室提供，该细胞加入含 10%小牛血清的DMEM培养液中，置37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，0. 25%的胰蛋 白消化传代；
[0031] (2)取对数期生长期860823细胞或当860823细胞培养至细胞密度达到80%时， 换新鲜DMEM培养液，加入二甲双胍，形成含二甲双胍的DMEM培养液，其中二甲双胍浓度为 25mmol/L，置37°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养，24小时后弃去含二甲双胍的 DMEM培养液，并用PBS液清洗2遍，加入新鲜DMEM培养液继续培养，使剩余细胞恢复到对数 生长期或细胞密度达到80 %并传代；
[0032] (3)重复步骤（2) 3至5次，其中使用含二甲双胍的DMEM培养液时，二甲双胍的浓 度为25mmol/L ;若3至5次重复培养仍无法达到稳定生长、传代，可增加重复培养的次数， 直到人胃癌BGC823细胞能在此浓度（二甲双胍浓度25mmol/L)的含二甲双胍的DMEM培养 液稳定生长、传代；
[0033] (4)取上一步获得的对数期生长期细胞或当细胞培养至细胞密度达到80%时，换 新鲜DMEM培养液，加入二甲双胍，形成含二甲双胍的DMEM培养液，其中二甲双胍浓度为 5 0 mmo I / L，置3 7 °C、5 % C O2、饱和湿